102. Plísně III. - askomycety - kropidlák (Aspergillus)

Stáhnout

Parametry úlohy

Teoretický úvod

Většina plísní, se kterými se můžeme v běžném životě setkat, patří z hlediska systematického do skupiny hub vřeckovýtrusých (Ascomycetes), jejichž název je odvozen od útvaru vznikajícího při jejich pohlavním rozmnožování. Tento útvar se nazývá vřecko – askus a výtrusy, které v něm vznikají (zpravidla 8 výtrusů v každém vřecku), pak nazýváme askospory. Plísně, které mezi askomycety patří, se však pohlavně množí spíš ojediněle. V převážné většině případů potkáváme tyto houby v jejich nepohlavním stadiu, tj. ve stadiu tvorby nepohlavních výtrusů. Tyto nepohlavní výtrusy se obvykle nazývají konidie a vyrůstají na specializovaných hyfách – konidioforech. V mnoha případech se nepohlavní stádium od stádia pohlavně se množícího natolik odlišuje, že byla v minulosti tato dvě stádia popsána jako různé organismy. Proto také někdy můžeme najít nepohlavní stádia hub řazena do zvláštní skupiny tzv. nedokonalých hub (Deuteromycetes; Fungi imperfecti). V rámci této skupiny jsou pak houby tříděny zejména na základě podobnosti rozmnožovacích = fruktifikačních orgánů (tvar a větvení konidioforů, způsob vyrůstání, velikost a tvar konidií apod.).

Kropidlák (Aspergillus) je velmi rozšířený rod plísní. Běžně se vyskytuje v půdě ve vodě, jeho spóry jsou obsaženy v ovzduší. Různé druhy tohoto rodu se jako saprofyté podílí na rozkladu organické hmoty, ale mohou působit i jako parazité živočichů nebo člověka. Makroskopický vzhled nejčastějších zástupců: obvykle zelené nebo šedozelené až šedočerné porosty sametového vzhledu (někteří zástupci mohou makroskopicky připomínat nárůsty štětičkovce), některé druhy mají jiné zbarvení – např. bílé, krémové žluté nebo oranžové porosty. Z mikroskopických charakteristik jsou významným rozlišovacím znakem kulovité – konidiofory, často na koncích měchýřkovitě rozšířené, z nichž do všech směrů vyrůstají konidie vznikající odškrcováním lahvicovitých dlouhých buněk tzv. fialid. Mnoho druhů produkuje významné mykotoxiny, k nejznámějším se řadí tzv. aflatoxiny (mají karcinogenní účinky a poškozují játra – hepatotoxicita) pojmenované podle druhu Aspergillus flavus.

Materiál

Plesnivé potraviny (pečivo, ovoce, marmelády) s plísněmi, které makroskopicky vykazují tyto znaky – nízké porosty sametového vzhledu, nejčastěji tmavě zbarvené (šedozelené, černozelené, černé). Při pohledu pod binokulární lupou je možné rozeznat konidiofory kulovitého tvaru (při zběžném pohledu je možné, pokud nemáme s pozorováním plísní dost zkušeností, zaměnit tyto konidiofory se sporangii kropidlovce (Rhizopus) se skupiny zygomycet).

Pomůcky

Stereomikroskop nebo lupa, mikroskop, podložní a krycí sklíčko, Petriho miska, 2 preparační jehly, žiletka nebo skalpel, pinzeta, kapátko, filtrační papír, voda, cottonová modř, popř. také ethanol, laktofenol nebo fyziologický roztok, libovolný desinfekční prostředek (na úklid a utření stolů po práci).

Úkoly

1. Pozorování kropidláku pod binokulární lupou

Mezi vzorky zplesnivělých potravin vyberte takový, na kterém pouhým okem pozorujete sametovou plíseň šedozeleného nebo černozeleného zbarvaní. Tuto plíseň i s kouskem substrátu, na kterém vyrůstá, přeneste do Petriho misky. S plísní manipulujte opatrně, abyste co nejméně poničili křehkou strukturu vláken mycelia. Vzorek v misce uzavřete víčkem a pozorujte pod binokulární lupou. Zaměřte se zejména na prostorové uspořádání vláken mycelia a způsob, jakým na nich vyrůstají fruktifikační orgány – konidiofory s konidiemi. Poznamenejte si také barvu vláken mycelia a konidií.

2. Mikroskopické pozorování kropidláku

Ze vzorku plísně, kterou jste pozorovali v úkolu č. 1., zhotovte preparát v kapce vody nebo fyziologického roztoku. Přikryjte krycím sklíčkem, odsajte přebytečnou tekutinu a pozorujte. Všímejte si stavby vláken mycelia (zda jsou či nejsou patrné přehrádky mezi buňkami), najděte konidiofor s konidiemi a pozorujte jejich stavbu. Zakreslete. Pozn.: Klíčem k úspěchu je vytvoření dobrého preparátu. Na sklíčko přenášejte pomocí preparačních jehel opravdu velmi malý kousek plísně a dobře jej rozprostřete. Dejte pozor, abyste nabrali pouze vlákna plísně a ne kus substrátu.

3. Mikroskopické pozorování kropidláku v preparátu barveném cottonovou modří

V nativním preparátu není většinou možné pozorovat detailní stavbu konidioforů a způsob vyrůstání konidií. Pro zvýraznění těchto morfologických znaků je třeba preparát obarvit.

Povedený nativní preparát (tj. takový, ve kterém zřetelně vidíte jak vlákna mycelia tak konidiofory) obarvěte roztokem cottonové modři (k jedné hraně krycího sklíčka přikápněte pár kapek barviva a filtračním papírem z druhé strany opatrně odsávejte přebytečnou tekutinu – zkontrolujte, že se celý preparát stejnoměrně probarvil, pokud ne, můžete velmi opatrně nadzvihnout růžek krycího sklíčka a znovu ho přiklopit). Nechte barvivo cca 2 – 3 minuty působit a preparát znovu prohlédněte. Zakreslete stavbu konidiofóru a způsob vyrůstání konidií.

Výsledky pozorování

Pod binokulární lupou pozorujeme, že z mycelia kropidláku vyrůstají kulovité konidiofory pokryté drobnými konidiemi. Zbarvení konidioforů a konidií je druhově charakteristické. V mikroskopu je jednoznačným poznávacím znakem tvar konidioforů – ty bývají obvykle na konci rozšířené v měchýřek a obalené drobnými kulovitými, zpravidla tmavými konidiemi. Po obarvení cottonovou modří pozorujeme, že z měchýřku vyrůstají podlouhlé buňky (často lahvicovitého tvaru) zvaní fialidy, jejichž odškrcováním se tvoří vlastní kulovité konidie plísně.

Metodické poznámky a doporučení

• Kropidlák je pro pozorování poměrně vhodnou plísní, velmi dobře se barví a na obarveném preparátu je stavba opravdu zřetelně vidět.
• Při manipulaci s plísněmi vedeme žáky k maximální opatrnosti, vzorky zplesnivělých potravin otvíráme jen na nezbytně nutnou dobu, pod binokulární lupou pozorujeme vzorky uzavřené v Petriho misce. Opatrnou manipulací s plísněmi bráníme šíření spór. Upozorníme žáky na nebezpečí plísní jako potencionálních patogenů. Po skončení práce si umyjeme ruce mýdlem a pracovní desky stolů otřeme např. zředěným roztokem SAVA, popř. jiným desinfekčním čisticím prostředkem.
• V souvislosti s kropidlákem můžeme žákům zdůraznit negativní význam mykotoxinů v potravinách a také je upozornit na skutečnost, že z kontaminované potraviny nestačí sejmout pouze plíseň (i když je jí tam malý kousek), ale vždy je nutné počítat s možností tvorby mykotoxinů a potravinu zlikvidovat celou.
• Při tvorbě mikroskopického preparátu je třeba manipulovat s plísní co nejopatrněji, sebrat pomocí preparačních jehel opravdu pouze mycelium plísně (bez částí substrátu) a pomocí preparačních jehel vzorek dobře narovnat a rozprostřít. Častou chybou jsou příliš husté preparáty, na kterých kvůli částicím substrátu nebo nahloučeným částem mycelia není možné prosvítit jednotlivá vlákna mycelia nebo pak preparáty, kde jsou pouze vysypané spory a kusy holých konidioforů (poškození v souvislosti s hrubou manipulací s křehkým objektem).
• Kropidlák (Aspergillus sp.) je v mikroskopickém preparátu díky stavbě konidioforů poměrně nezaměnitelným rodem. Pro bližší určování plísní (např. do druhů) může posloužit řada internetových zdrojů. Jedním z nich je tento Miniatlas mikroorganismů na stránkách VŠCHT, popř. přehled zástupců vybraných mikroskopických askomycet na stránkách katedry botaniky PřF UK nebo také atlas houbových organismů na stránkách PřF UP.
• Substrát pro pěstování plísní je třeba připravit v dostatečném předstihu (min. týden před konáním praktického cvičení) – nechat plíseň růst na vhodném místě – ideálními podmínkami jsou pokojová teplota, vlhko a přístup vzduchu, ideálním substrátem např. chléb.
• Některé druhy plísní jsou velmi těžko smáčitelné, takže je obtížné připravit preparát bez vzduchových bublin. V takových případech je možné připravit preparát do etanolu a ten postupně nahradit vodou (z jedné strany přidáváme vodu a z druhé odsáváme etanol filtračním papírem). Pro kreslení, identifikaci, popř. měření je vhodnější připravovat preparát v laktofenolu, pro běžné školní pozorování však stačí preparáty ve vodě nebo fyziologickém roztoku.
• Dalšími druhy plísní se zabývají také úlohy 100, 101, 103, 104, 105 a 106.

Obrazová dokumentace

Kropidlák (Aspergillus sp.) – Skupina konidioforů s konidiemi. Stereomikroskop model SZS 1002-T ZOOM; objektiv – zoom 3/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – stopka konidioforu; 2 – kulovitý konidiofor s konidiemi; 3 – hyfy dalších druhů plísní

Kropidlák (Aspergillus sp.) – Konidiofory s konidiemi. Vitální preparát ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv zleva 10, 20, 40/okulár 10 + kamera CMOS 2	1 – stopka konidioforu; 2 – kulovitý konidiofor; 3 – konidie; 4 – hyfy mycelia

Kropidlák (Aspergillus sp.) – Konidiofory s konidiemi. Vitální preparát obarvený cottonovou modří. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 20, 40/okulár 10 + kamera CMOS 2	A – pohled na konidiofory s konidiemi; B;C – detail stavby konidioforů; 1 – stopka; 2 – měchýřek; 3 – fialidy; 4 – konidie