9. Buňka XI. - mitóza v meristému kořenové špičky fazolu

Parametry úlohy

	Obtížnost:	těžké
	Časová náročnost:	80 minut
	Materiálová náročnost:	náročné
	Druh materiálu:	kulturní rostliny
	Čím pozorujeme:	mikroskop
	Téma:	Buňka Krytosemenné rostliny dvouděložné
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Mitóza neboli nepřímé dělení jader somatických buněk zajišťuje přesné rozdělení genetického materiálu tak, že dvě nově vzniklé dceřiné buňky obsahují stejnou genetickou informaci jako původní buňka mateřská. Před dělením jádra dochází k replikaci DNA. Vlastní dělení má 4 fáze. V profázi se chromozómy spiralizují, stávají se barvitelnými, mizí jaderná blána. V metafázi se chromozómy seřadí v ekvatoriální rovině buňky, počíná tvorba dělícího vřeténka (achromatické = není zbarveno). V anafázi se vlákna vřeténka zkracují a tím dojde k oddělení části replikovaného chromozómu i v oblasti centroméry. Buňka se prodlužuje a oddělené části chromozómů jsou vřeténkem taženy k opačným pólům buňky. V telofázi se kolem skupin chromozómů na opačných pólech buňky vytvoří jaderná membrána a dojde k rozdělení cytoplazmy. Výsledkem je vznik 2 dceřiných buněk. Nejlepším materiálem pro pozorování mitózy je meristém špiček náhradních kořenů cibule kuchyňské (Allium cepa) (viz úloha 8). Běžně uváděným materiálem (tedy určitou alternativou) jsou i špičky kořenů fazolu (Phaseolus sp.).

Mitóza je součástí tzv. buněčného cyklu, což je období od počátku jednoho dělení buňky do okamžiku začátku dalšího dělení. Buněčný cyklus lze rozdělit na interfázi (ta se ještě dále dělí na G1, S a G2 fázi), ve které se buňka připravuje na dělení, tzn. replikuje DNA, vytváří struktury nutné k průběhu dělení a syntetizuje dostatek buněčné hmoty pro obě nově vzniklé buňky, a potom vlastní M fázi – mitózu (fáze mitózy viz výše). Buněčný cyklus různých buněk bývá různě dlouhý, obvykle se uvádí, že interfáze probíhá 90 – 95 % času z celkové délky buněčného cyklu, mitóza pak zbývajících 5 – 10 %. Z mitózy pak největší podíl času připadá pravděpodobně na profázi. V souvislosti s procesy, které v průběhu ní probíhají, jde zejména o spiralizaci chromozomů.

Materiál

Naklíčené kořeny fazolu (Phaseolus sp.).

Pomůcky

Mikroskop, podložní a krycí sklíčko, 3 Petriho misky s víčkem, špejle nebo párátka, žiletka, filtrační papír, fixační roztok, macerační roztok, barvivo (acetokarmín, acetonigrosin), voda.

Úkoly

1. Pozorování fází mitózy v preparátu barveném acetokarmínem nebo acetonigrosinem

Z klíčících kořenů fazolu odřízněte kořenové špičky (cca 0,5 cm), vložte je na 10 minut do fixační směsi v Petriho misce, následně na 10 min do macerační směsi a na 10 min do destilované vody. Dodržujte bezpečnost práce – kořínky převádějte párátky, nikoli kovovými předměty. Dávejte si pozor na ukápnutí tekutiny na stolek. Oprané kořínky přendejte na podložní sklo a odřízněte špičku s meristémy (asi 1 mm dlouhá jasně bílá špička, která se barvou odlišuje od zbytku kořínku). Ke špičce kořínku přikápněte kapku acetokarmínu nebo acetonigrosinu a překryjte šikmo krycím sklem (roh krycího skla přesahuje šikmo přes hranu skla podložního). Opatrně zatlačte bříškem palce na krycí sklo a kořínek rozmáčkněte (buňky se rozestoupí do jedné roviny). Není-li střed preparátu probarvený (růžový, šedý), nadzdvihněte za růžek krycí sklo, aby barvivo mohlo vniknout do středu preparátu (příp. ještě kapku barviva přikápněte). Na rovnoměrně probarveném preparátu posuňte krycí sklo do správné polohy a mikroskopujte. (Pozor na znečištění mikroskopu barvivem s obsahem kyseliny.)

2. Stanovení relativní doby trvání jednotlivých fází mitózy

Ve zdařilém preparátu najděte dobře obarvený meristém. Při zvětšení, v němž dobře rozlišíte jednotlivé buňky, počítejte buňky v jednotlivých fázích mitózy. Výsledky zaznamenávejte do tabulky (naše tabulka je uvedena ve výsledcích pozorování). Spočítejte buňky ve 4 – 5 zorných polích (z různých míst vašeho preparátu). Následně sečtěte v tabulce údaje s počty buněk v různých fázích mitotického cyklu ze všech 4 (5) zorných polí a vypočítejte % podíl buněk v každé fázi buněčného cyklu (% z celkového počtu sledovaných buněk). Procentuální podíl buněk v dané fázi představuje relativní podíl dané fáze na celkovém trvání buněčného cyklu. Vycházíme z faktu, že čím déle daná fáze trvá, tím více buněk v té fázi v okamžiku fixace kořínku zastihneme. Pro zpřesnění výpočtu porovnejte své výsledky se 4 spolužáky a závěr (která fáze trvá nejdéle, která je nejkratší, jakou část buněčného cyklu je buňka v interfázi a jaká část připadá na vlastní mitózu) vyslovte na základě výpočtu průměru hodnot získaných z 5 vzorků (tedy údajů svého vzorku a údajů ze vzorků 4 dalších spolužáků).

Výsledky pozorování

V barveném preparátu pozorujeme téměř čtvercové buňky meristému. Buňky v interfázi mají nezřetelné nebo málo zřetelné jádro. U buněk v profázi se jádro zvýrazňuje a jsou viditelné spiralizující se chromozomy. V metafázi je zbarvená skupina chromozómů nahloučena uprostřed buňky a v anafázi se od středu začínají rozestupovat dvě skupiny chromozomů. Jako telofázi označujeme buňky které jsou o něco menší než ostatní buňky, zpravidla bývají ještě výrazně blízko u sebe. Dobře identifikovatelnými fázemi jsou metafáze a anafáze. Přechod mezi interfází/profází a telofází/interfází je nezřetelný a do jisté míry ho v našem příkladu odhadujeme. Pro výpočet používáme ty buňky, které jsou na fotografii většinou své části. Fotografie, které pro ukázkový výpočet používáme, nezachycují celá zorná pole, jedná se o výřezy se zřetelnými mitotickými fázemi. V souvislosti s tím bude náš výpočet pravděpodobně zkreslený, nicméně jako ukázka metodiky bude postačující. Jako 4 vzorky slouží fotografie (a dle nich nakreslené obrázky) – vzorek 1 = obr. 1A; vzorek 2 = obr. 1B; vzorek 3 = obr. 2; vzorek 4 = obr. 3.

Fáze buněčného cyklu	Vzorek 1 (obr. 1A)	Vzorek 2 (obr. 1B)	Vzorek 3 (obr. 2)	Vzorek 4 (obr. 3)	Celkem	%
Interfáze	81	22	19	45	167	80,3 %
Profáze	2	3	3	3	11	5,3 %
Metafáze	1	0	3	3	7	3,4 %
Anafáze	4	1	3	6	14	6,7 %
Telofáze	0	3	3	3	9	4,3 %
Celkem	88	29	31	60	208	100 %

Z našeho zjištění vyplývá, že interfáze trvá zhruba 80 % z celkové délky buněčného cyklu. Nejkratší částí buněčného dělení je metafáze, jako nejdelší se jeví anafáze, následovaná profází. Tyto výsledky bychom porovnali s %, která vyšla 4 dalším spolužákům, a dobu trvání bychom stanovili jako aritmetický průměr výsledků 5 vzorků (preparátů).

Metodické poznámky a doporučení

Fazol je alternativou pro pozorování mitózy, cibule je ale jednoznačně lepším materiálem. Buňky meristému jsou větší a chromozomy mnohem zřetelnější.
Na cvičení je nutné připravit se předem: zhruba 2 týdny před konáním cvičení necháme naklíčit semena fazolu (nejlépe na navlhčené vatě nebo buničině).
Kořínky pro cvičení ostříháme a vložíme do fixační směsi ráno (mitóza probíhá nejintenzivněji mezi 5 – 9 hodinou ranní) – v této směsi je možné je nechat až do odpoledních hodin. U cibule máme zkušenost, že když ostříháme kořínky odpoledne, žádné (nebo téměř žádné) dělící buňky nelze pozorovat. Všechny (či téměř všechny) buňky meristému jsou v interfázi. S fazolem nepracujeme tak často, abychom měli tuto skutečnost potvrzenou.
Při manipulaci s kořínky (přendavání z fixační do macerační směsi a následně pak do vody) používáme párátka nebo špejle, ne kovové nástroje (směsi obsahují kyseliny způsobující korozi nástrojů).
Důrazně upozorníme žáky na bezpečnost práce, zejména v souvislosti s užíváním roztoků s obsahem kyselin.
V průběhu fixace a macerace je vhodné zavírat Petriho misky s kořínky, protože fixační i macerační směs nepříjemně dráždivě čpí.
Oba roztoky po použití nalejeme zpět do zásobních lahví, fixační i macerační roztok lze užívat opakovaně.
Pro lepší probarvení při použití acetokarmínu můžeme obarvený preparát lehce zahřát nad kahanem (teplota nesmí přesáhnout 60°C – kontrolujeme položením skla na hřbet ruky). Preparáty barvené acetonigrosinem se nezahřívají.
Pro barvení dělících se chromozomů lze kromě uvedených barviv užít také acetoorcein – při barvení postupujeme stejně jako při užití acetonigrosinu.
Pozorování mitózy patří z hlediska užití na střední škole k obtížnějším úlohám nejen z důvodu složitější připravy preparátu, ale i vlastního mikroskopického pozorování. Máme zkušenost, že pro většinu studentů je poměrně obtížné vytvořit kvalitní preparát a objekt v něm vyhledat. Doporučujeme zařadit tuto úlohu ve vyšších ročnících, tehdy když mají studenti s mikroskopií již nějaké zkušenosti.
Výsledky naší úlohy (viz výsledky pozorování) se odchylují od běžně uváděných údajů. Mitóza dle nich představuje 20 % buněčného cyklu, rovněž profáze nevyšla jako nejdelší z mitotických fází. Jedním z důvodů je skutečnost, že poznat, co již je a co ještě není profáze/interfáze/telofáze, není zpravidla jednoduché. Druhým důvodem je to, že fotografie zahrnují malý počet buněk – jedná se o výřezy zvolené za účelem demonstrace jednotlivých fází. Nejsouvislejší vzorek s největším počtem buněk obsahuje obrázek 1A. Tam už se poměr buněk v interfázi a buněk nacházejících se v některé z mitotických fází shoduje s obecně uváděným číslem (interfáze představuje 92 % buněk vzorku). Nejméně věrohodný je vzorek 3, který obsahuje nejméně buněk a rovněž zkresluje celkový výsledek. Při průměrování vzorků 5 různých žáků se jistě dopracujete věrohodnějších výsledků. Jako ukázka metodiky však i naše výřezové fotografie postačí.
K tématu buňka se vztahují také úlohy 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 a 8.

Obrazová dokumentace


Fazol (Phaseolus sp.) – Meristém kořenové špičky s buňkami v různých fázích mitotického dělení. Vitální preparát ve vodě, fixováno, macerováno, obarveno acetokarmínem a acetonigrosinem. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	Buňky v různých fázích buněčného cyklu. Obrázek 1A: interfáze (i) 81×; profáze (p) 2×; metafáze (m) 1×; anafáze (a) 4×; telofáze (t) 0×; 1B: interfáze (i) 22×; profáze (p) 3×; metafáze (m) 3×; anafáze (a) 1×; telofáze (t) 3×


Fazol (Phaseolus sp.) – Meristém kořenové špičky s buňkami v různých fázích mitotického dělení. Vitální preparát ve vodě, fixováno, macerováno, obarveno acetokarmínem. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	Buňky v různých fázích buněčného cyklu: interfáze (i) 19×; profáze (p) 3×; metafáze (m) 3×; anafáze (a) 3×; telofáze (t) 3×


Fazol (Phaseolus sp.) – Meristém kořenové špičky s buňkami v různých fázích mitotického dělení. Vitální preparát ve vodě, fixováno, macerováno, obarveno acetonigrosinem. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	Buňky v různých fázích buněčného cyklu: interfáze (i) 45×; profáze (p) 3×; metafáze (m) 3×; anafáze (a) 6×; telofáze (t) 3×