8. Buňka VIII. - mitóza v meristému kořenových špiček náhradních kořenů cibule

Parametry úlohy

	Obtížnost:	těžké
	Časová náročnost:	80 minut
	Materiálová náročnost:	náročné
	Druh materiálu:	kulturní rostliny
	Čím pozorujeme:	mikroskop
	Téma:	Buňka Krytosemenné rostliny jednoděložné
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Mitóza neboli nepřímé dělení jader somatických buněk zajišťuje přesné rozdělení genetického materiálu tak, že dvě nově vzniklé dceřiné buňky obsahují stejnou genetickou informaci jako původní buňka mateřská. Před dělením jádra dochází k replikaci DNA. Vlastní dělení má 4 fáze. V profázi se chromozómy spiralizují, stávají se barvitelnými, mizí jaderná blána. V metafázi se chromozómy seřadí v ekvatoriální rovině buňky, počíná tvorba dělícího vřeténka (achromatické = není zbarveno). V anafázi se vlákna vřeténka zkracují a tím dojde k oddělení části replikovaného chromozómu i v oblasti centroméry. Buňka se prodlužuje a oddělené části chromozómů jsou vřeténkem taženy opačným pólům buňky. V telofázi se kolem skupin chromozómů na opačných pólech buňky vytvoří jaderná membrána a dojde k rozdělení cytoplazmy. Výsledkem je vznik 2 dceřiných buněk. Mitózu lze dobře pozorovat v buňkách meristému vzrostného vrcholu kořene některých rostlin. Ideálním rostlinným materiálem jsou adventivní kořeny cibule kuchyňské (Allium cepa).

Materiál

Cibule kuchyňská (Allium cepa) s naklíčenými kořeny (cibuli je třeba připravit cca 2 týdny předem – více viz metodické poznámky a doporučení).

Pomůcky

Mikroskop, podložní a krycí sklíčko, 3 Petriho misky s víčkem, špejle nebo párátka, žiletka, filtrační papír, fixační roztok, macerační roztok, barvivo (acetokarmín, acetonigrosin), voda.

Úkoly

1. Pozorování fází mitózy v preparátu barveném acetokarmínem

Z rychlených cibulek odřízněte kořenové špičky (cca 0,5 cm), vložte je na 10 minut do fixační směsi v Petriho misce, následně na 10 min do macerační směsi a na 10 min do destilované vody. Dodržujte bezpečnost práce – kořínky převádějte párátky, nikoli kovovými předměty a dávejte si pozor na ukápnutí tekutiny na stolek. Oprané kořínky přendejte na podložní sklo a odřízněte špičku s meristémy (asi 1 mm dlouhá jasně bílá špička, která se barvou odlišuje od zbytku kořínku). Ke špičce kořínku přikápněte kapku acetokarmínu a překryjte šikmo krycím sklem (roh krycího skla přesahuje šikmo přes hranu skla podložního). Opatrně zatlačte bříškem palce na krycí sklo a kořínek rozmáčkněte (buňky se rozestoupí do jedné roviny). Není-li střed preparátu probarvený (růžový), nadzdvihněte za růžek krycí sklo, aby barvivo mohlo vniknout do středu preparátu (příp. ještě kapku barviva přikápněte). Na rovnoměrně probarveném preparátu posuňtě krycí sklo do správné polohy a mikroskopujte (pozor na znečištění mikroskopu barvivem s obsahem kyseliny).

2. Pozorování fází mitózy v preparátu barveném acetonigrosinem

Barvíme-li acetonigrosinem, postupujte stejně jako v předchozím úkolu při použití acetokarmínu. Přebytečné barvivo odsajte proužkem filtračního papíru a před vložením pod mikroskop zkontrolujte, že je preparát stejnoměrně šedý.

Výsledky pozorování

V preparátu barveném acetokarmínem pozorujeme téměř čtvercové buňky meristému s růžově až červeně obarvenými jádry. Některé buňky mají obarvené pentice chromozomů a ukazují buňky zafixované v různých fázích mitotického dělení. Ve zdařilém preparátu můžeme nalézt všechny fáze mitózy v jednom preparátu.

V preparátu barveném acetonigrosinem mají buňky meristému jádra zbarvená do šeda. Pentlice spiralizovaných chromozomů jsou pak zbarvené černě.

Metodické poznámky a doporučení

Na cvičení je nutné přípravit se předem: 1 – 2 týdny před konáním cvičení necháme naklíčit kořeny cibule. Vhodnou sklenici (např. od výživy, od majolky apod.) naplníme vodou a cibuli na ni posadíme tak, aby podpučí, ze kterého vyrůstají kořínky, bylo ponořené ve vodě. Odpařenou vodu doplňujeme odstátou vodou (kořínky jsou citlivé na změnu teplot).
Kořínky pro cvičení ostříháme a vložíme do fixační směsi ráno (mitóza probíhá nejintenzivněji mezi 5 – 9 hodinou ranní). V této směsi je možné je nechat až do odpoledních hodin. Máme zkušenost s tím, že když ostříháme kořínky odpoledne, žádné (nebo téměř žádné) dělící buňky nelze pozorovat. Všechny (či téměř všechny) buňky meristému jsou v interfázi.
Při manipulaci s kořínky (přendavání z fixační do macerační směsi a následně pak do vody) používáme párátka nebo špejle, ne kovové nástroje (směsi obsahují kyseliny způsobující korozi nástrojů).
Důrazně upozorníme žáky na bezpečnost práce, zejména v souvislosti s užíváním roztoků s obsahem kyselin.
Petriho misky s kořínky v průběhu fixace a macerace je vhodné zavírat, fixační i macerační směs nepříjemně dráždivě čpí.
Oba roztoky po použití nalejeme zpět do zásobních lahví, fixační i macerační roztok lze užívat opakovaně.
Pro lepší probarvení při použití acetokarmínu můžeme obarvený preparát lehce zahřát nad kahanem (teplota nesmí přesáhnout 60°C – kontrolujeme položením skla na hřbet ruky). Preparáty barvené acetonigrosinem se nezahřívají.
Pro barvení dělících se chromozomů lze kromě uvedených barviv užít také acetoorcein. Při barvení postupujeme stejně jako při užití acetonigrosinu.
Pozorování mitózy patří z hlediska užití na střední škole k obtížnějším úlohám nejen z důvodu složitější přípravy preparátu, ale i vlastního mikroskopického pozorování. Máme zkušenost, že pro většinu studentů je poměrně obtížné vytvořit kvalitní preparát a objekt v něm vyhledat. Doporučujeme zařadit tuto úlohu ve vyšších ročnících, tehdy když mají studenti s mikroskopií již nějaké zkušenosti.
K tématu buňka se vztahují také úlohy 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 a 9.

Obrazová dokumentace

Cibule kuchyňská (Allium cepa) – Meristém kořenové špičky s buňkami v různých fázích mitotického dělení. Vitální preparát ve vodě, fixováno, macerováno, obarveno acetokarmínem. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 20/okulár 10 + kamera CMOS 2

1 – profáze (spiralizace chromozomů); 1a – pokročilá profáze (nebo počínající metafáze – spiralizované chromozomy se počínají řadit v ekvatoriální rovině buňky); 2 – metafáze (útvar zvaný monaster = jedna hvězda – chromozomy v ekvatoriální rovině buňky vytvářejí hvězdici); 3 – anafáze (útvar zvaný diaster = dvě hvězdy – chromozomy tažené dělicím vřeténkem k opačným pólům vytvářejí dvě hvězdice); 3a – pokročilá anafáze; 4 – telofáze (chromozomy se despiralizují, následuje cytokineze – rozdělení cytoplazmy); 5 – meristematická buňka v interfázi; 6 – jádro meristematické buňky

Cibule kuchyňská (Allium cepa) – Meristém kořenové špičky s buňkami v různých fázích mitotického dělení. Vitální preparát ve vodě, fixováno, macerováno, obarveno acetonigrosinem. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 20/okulár 10 + kamera CMOS 2

1 – profáze (spiralizace chromozomů); 2 – metafáze (útvar zvaný monaster = jedna hvězda – chromozomy v ekvatoriální rovině buňky vytvářejí hvězdici); 3 – anafáze (útvar zvaný diaster = dvě hvězdy – chromozomy tažené dělicím vřeténkem k opačným pólům vytvářejí dvě hvězdice); 4 – telofáze (chromozomy se despiralizují, následuje cytokineze – rozdělení cytoplazmy); 5 – meristematická buňka v interfázi; 6 – jádro meristematické buňky

Cibule kuchyňská (Allium cepa) – Detaily jednotlivých fází mitózy – nahoře profáze a metafáze, dole anafáze a telofáze. Vitální preparát ve vodě, fixováno, macerováno, obarveno acetokarmínem (červené) a acetonigrosinem (černé). Mikroskop LP 3012-T; objektiv 20/okulár 10 + Nikon Coolpix L20, zoom