120. Fluorescenční mikroskopie II.

Parametry úlohy

	Obtížnost:	středně těžké
	Časová náročnost:	60 minut
	Materiálová náročnost:	náročné
	Druh materiálu:	volně rostoucí a kulturní rostliny
	Čím pozorujeme:	mikroskop
	Téma:	Rostlinné orgány vegetativní Rozmnožování rostlin, rostlinné orgány generativní Výtrusné rostliny Krytosemenné rostliny jednoděložné Krytosemenné rostliny dvouděložné
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Některé látky tzv. fluorofory po ozáření (excitaci) světlem určité vlnové délky vyzařují (emitují) světlo jiné vlnové délky. Tento jev se nazývá fluorescence a je jej možno pozorovat při použití speciálního fluorescenčního mikroskopu. Vyzářený foton má méně energie, protože při každé přeměně energie dochází ke ztrátám (část energie se uvolní do prostředí v podobě tepla). Protože světlo má vlnovou povahu, je vlnová délka vyzářeného (emitovaného) světla delší, než vlnová délka světla, které fluorescenci vybudilo (excitovalo). Např. chlorofyl při ozáření modrým světlem emituje světlo červené. S fluorescenční mikroskopií je spjato udělení Nobelovy ceny za chemii v roce 2008. Cenu získali O. Shimomura, M. Chalfie a R. Y. Tsien v souvislosti s objevením a využitím fluorescenčního proteinu GFP. Nejširší užití má fluorescenční mikroskopie v oblasti buněčné biologie a molekulární genetiky (zviditelnění některých buněčných struktur – jádro, cytoskelet, nalézání určitých sekvencí v DNA či RNA, nalézání specifických molekul bílkovin, lipidů či sacharidů, značkování buněk a sledování jejich činnosti apod.).

Při pozorování fluorescenčním mikroskopem lze využít jevu zvaného autofluorescence (některé látky tvořící buňky se chovají jako fluorofory – např. chlorofyl, celulóza, keratin aj.) nebo použít barvení speciálními barvivy – fluorescenční barvení (toto barvení se využívá ke zviditelnění molekul a buněk, které nemají autofluorescenci). Fluorescenční barvivo je barvivo, jehož molekuly jsou schopny fluorescence, např. akridinová oranž.

Materiál

Trofosporofyl či sporofyl s výtrusnicemi jakékoliv kapradiny – např. kapradě samce (Dryopetris filix-mas); hasivky orličí (Pteridium aquilinum), sleziníku červeného (Asplenium trichomanes); nedozrálé dvounažky některé miříkovité rostliny – např. mrkev obecná (Daucus carota); fenykl obecný (Foeniculum vulgare); stonek sítiny (Juncus sp.); orobince (Typha sp.); ostřice (Carex sp.), přesličky (Equisetum sp.), oddenek hasivky orličí (Pteridium aquilinum).

Pomůcky

Mikroskop, podložní a krycí sklíčka, preparační jehla, pinzeta, kapátko, filtrační papír, voda.

Úkoly

1. Pozorování výtrusnic kapradin – autofluorescence

Na suché podložní sklíčko seškrábněte pomocí preparační jehly výtrusnice kapradiny z kupek na spodní straně trofosporofylů a pozorujte pod fluorescenčním mikroskopem. Zakreslete a do obrázku označte, které části mají nejvýraznější autofluorescenci.

2. Pozorování stavby dvounažky miříkovitých rostlin na příčném řezu – autofluorescence

Žiletkou vytvořte tenký příčný řez nažkou libovolné miříkovité rostliny, připravte preparát v kapce vody, přikryjte krycím sklíčkem a pozorujte pod fluorescenčním mikroskopem. Zakreslete a do obrázku označte, které části mají nejvýraznější autofluorescenci.

3. Pozorování stavby stonků a listů různých rostlin na příčném řezu – autofluorescence

Žiletkou řežte tenké příčné kolmé řezy stonky nebo listy různých rostlin. Z většího počtu vytvořených řezů vyberte ten nejtenčí a připravte z něj preparát v kapce vody. Přikryjte krycím sklíčkem a pozorujte pod fluorescenčním mikroskopem. Zakreslete a do obrázku označte, které části mají nejvýraznější autofluorescenci.

4. Pozorování stavby oddenku hasivky orličí na příčném řezu – autofluorescence

Z očištěného a omytého oddenku hasivky orličí řežte žiletkou tenké příčné kolmé řezy stonky různých rostlin. Z většího počtu vytvořených řezů vyberte ten nejtenčí a připravte z něj preparát v kapce vody. Přikryjte krycím sklíčkem a pozorujte pod fluorescenčním mikroskopem. Zakreslete schématicky stavbu oddenku a do obrázku označte, které části mají nejvýraznější autofluorescenci.

Výsledky pozorování

Na výtrusnicích kapradin můžeme velmi dobře pozorovat prstenec, umožňující otevírání výtrusnice. Tento prstenec má také nejvýraznější autofluorescenci – tvoří jej buňky s výrazně (nestejnoměrně) ztloustlými buněčnými stěnami. Na výstavbě sekundárně ztloustlých buněčných stěn rostlin se podílí celulóza, což je jedna z látek vykazujících autofluorescenci. Na rozdíl od pozorování běžným mikroskopem se obraz výtrusnic jeví jako prostorový, nikoli dvojrozměrný.

Na stavbě nažky miříkovitých rostlin lze vidět po obvodu žebra, která jsou pro nažky této čeledi typická. Nejsilnější autofluorescenci mají siličné kanálky umístěné po obvodu každé z nažek.

Na příčných řezech stonky a listy rostlin lze pozorovat různě zbarvené struktury s různou intenzitou autofluorescence. Velmi dobře bývají rozeznatelné cévní svazky, event. asimilační pletiva (s vysokým obsahem chlorofylu – chlorofyl je, vedle celulózy, další látkou s autofluorescencí). Na našich fotografiích jsou vybrány řezy orgány vodních a bahenních rostlin – nemají příliš vyvinuté dřevní části cévních svazků, proto autofluorescence není tak výrazná.

Na příčném řezu oddenkem hasivky orličí mají největší autofluorescenci dřevní (středové) části dřevostředných cévních svazků.

Metodické poznámky a doporučení

Fotografie z fluorescenčního mikroskopu jsme pořídili na přístroji zapůjčeném z PřF UK v Praze. Mikroskop byl pořízen z prostředků MŠMT v rámci grantu, jehož řešitelem byla katedra buněčné biologie PřF UK a je nabízen k zapůjčení středním školám. Více informací najdete zde.
Cílem těchto úloh je nabídnout pár námětů k tomu, co pozorovat, pokud se s žáky dostaneme k fluorescenčnímu mikroskopu. Většina námětů je podrobněji popsaná v jiných úlohách naší databáze. Postup přípravy preparátů je zde proto poněkud zestručněn a důraz je v návodu kladen pouze na nový prvek – užití fluorescenčního mikroskopu, event. fluorescenčního barvení.
V této úloze je řada úkolů zaměřena na řezy. Nezbytnou pomůckou pro vytvoření dostatečně tenkých řezů je opravdu ostrá žiletka.
Řezy rostlinným materiálem můžeme zkusit u kterékoliv rostliny, zpravidla vypadají pod fluorescenčním mikroskopem dobře i bez barvení – autofluorescence.
Stavbě stonků a listů různých rostlin na příčném řezu a popisu pozorovaných struktur se podrobněji věnuje řada úloh z naší databáze. Tyto úlohy lze vyhledat zadáním kritérí pro vyhledávání – Téma: Rostlinné orgány vegetativní.
Práce s fluorescenčním mikroskopem je pro žáky zajímavým zpestřením.
Z hlediska ročního období lze úlohu zařadit kdykoliv, protože pro řezy můžeme použít libovolné rostlinné orgány (např. i pokojových rostlin). Výtrusnice kapradin lze uchovávat ve školních sbírkách, jako dvounažku miříkovitých můžeme použít koupené koření (kmín, fenykl, anýz).
Další náměty pro pozorování objektů ve fluorescenčním mikroskopu přináší úloha 119.
Zajímavými objekty pro pozorování jsou i některé organismy z živočišné říše. Pozorovat lze různé drobné zástupce hmyzu nebo např. šupiny z motýlích křídel.
Úloha je zařazena mezi „materiálově náročné“, i když pracuje s běžně dostupným rostlinným materiálem. Důvodem tohoto zařazení je to, že úloha vyžaduje užití fluorescenčního mikroskopu, který není pro většinu škol zařízením běžně dostupným.

Obrazová dokumentace


Vlevo: Kapradiny (Polypodiophyta sp.) – Výtrusnice; Vpravo: Miříkovité (Apiaceae sp.) – Příčný řez dvojnažkou. Vitální preparát ve vodě – autofluorescence. Vhodné zvětšení pro pozorování 100 – 200×.	A; B – výtrusnice kapradin; C – dvounažka na příčném řezu; 1 – výtrusnice; 2 – prstenec buněk se zesílenými stěnami; 3 – siličný kanálek; 4 – žebro nažky; 5 – endosperm; 6 – nažka


Vlevo nahoře: Orobinec (Typha sp.) – Příčný řez listem; Vlevo dole: Sítina (Juncus sp.); Vpravo: Ostřice (Carex sp.) – Příčné řezy stonkem. Vitální preparát ve vodě – autofluorescence. Vhodné zvětšení pro pozorování 100 – 200×.	A – stavba listu bahenní rostliny na příčném řezu; B; C – stavba stonku bahenní rostliny na příčném řezu; 1 – krycí pletiva; 2 – primární kůra; 3 – cévní svazek; 4 – buňky aerenchymu; 5 – dutiny aerenchymu – interceluláry; 6 – asimilační pletivo – buňky s velkým množstvím chloroplastů

Vlevo: Hasivka (Pteridium sp.) – Příčný řez oddenkem; Vpravo: Přeslička lesní (Equisetum sylvaticum) – Příčný řez stonkem. Vitální preparát ve vodě – autofluorescence. Vhodné zvětšení pro pozorování 100 – 200×.

A – stavba oddenku kapradiny na příčném řezu; B – stavba stonku přesličky na příčném řezu; 1 – dřevostředný cévní svazek; 2 – dřevní část cévního svazku; 3 – lýková část cévního svazku; 4 – základní parenchym; 5 – sklerenchym pod pokožkou oddenku; 6 – pokožka (epidermis); 7 – sklerenchym v žebrech stonku; 8 – parenchym primární kůry; 9 – chlorenchym; 10 – valekulární dutina; 11 – kolaterální cévní svazek; 12 – karinální dutina; 13 – centrální dutina