119. Fluorescenční mikroskopie I.

Parametry úlohy

	Obtížnost:	středně těžké
	Časová náročnost:	60 minut
	Materiálová náročnost:	náročné
	Druh materiálu:	volně rostoucí a kulturní rostliny
	Čím pozorujeme:	mikroskop
	Téma:	Buňka Nižší rostliny Rozmnožování rostlin, rostlinné orgány generativní Nahosemenné rostliny Krytosemenné rostliny jednoděložné
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Některé látky tzv. fluorofory po ozáření (excitaci) světlem určité vlnové délky vyzařují (emitují) světlo jiné vlnové délky. Tento jev se nazývá fluorescence a je jej možno pozorovat při použití speciálního fluorescenčního mikroskopu. Vyzářený foton má méně energie, protože při každé přeměně energie dochází ke ztrátám (část energie se uvolní do prostředí v podobě tepla). Protože světlo má vlnovou povahu, je vlnová délka vyzářeného (emitovaného) světla delší, než vlnová délka světla, které fluorescenci vybudilo (excitovalo). Např. chlorofyl při ozáření modrým světlem emituje světlo červené. S fluorescenční mikroskopií je spjato udělení Nobelovy ceny za chemii v roce 2008. Cenu získali O. Shimomura, M. Chalfie a R. Y. Tsien v souvislosti s objevením a využitím fluorescenčního proteinu GFP. Nejširší užití má fluorescenční mikroskopie v oblasti buněčné biologie a molekulární genetiky (zviditelnění některých buněčných struktur – jádro, cytoskelet, nalézání určitých sekvencí v DNA či RNA, nalézání specifických molekul bílkovin, lipidů či sacharidů, značkování buněk a sledování jejich činnosti apod.).

Při pozorování flurescenčním mikroskopem lze využít jevu zvaného autofluorescence (některé látky tvořící buňky se chovají jako fluorofory – např. chlorofyl, celulóza, keratin aj.) nebo použít barvení speciálními barvivy – fluorescenční barvení (toto barvení se využívá ke zviditelnění molekul a buněk, které nemají autofluorescenci). Fluorescenční barvivo je barvivo, jehož molekuly jsou schopny fluorescence. např. akridinová oranž.

Materiál

Pyl různých rostlin, cibule kuchyňská (Allium cepa), rašeliník (Sphagnum sp.) nebo jakýkoliv jiný mech, vzorky stojatých a tekoucích vod se zástupci řas.

Pomůcky

Mikroskop, podložní a krycí sklíčka, preparační jehla, pinzeta, kapátko, filtrační papír, voda, fluorescenční barvivo – akridinová oranž.

Úkoly

1. Pozorování pylových zrn rostlin s využitím autofluorescence

Na suché podložní sklíčko sklepněte trochu pylu z květu svíčkovce a vložte pod fluorescenční mikroskop. Pozorujte a zakreslete tvar pylových zrn. Totéž proveďte s pylem smrku či jakékoliv jiné rostliny.

2. Pozorování buněk a jader v preparátech barvených akridinovou oranží

Na podložní sklíčko do kapky vody vložte malý kousek pokožky sloupnuté z vnitřní strany suknice cibule, narovnejte ho pomocí preparačních jehel aby nebyl pomačkaný a přikápněte malou kapku akridinové oranže. Přikryjte krycím sklíčkem a pozorujte pod fluorescenčním mikroskopem. Všímejte si tvaru buněk, zejména však obarvených jader. Zakreslete. Do kapky vody na podložní sklíčko vložte lístek mechu (např. rašeliníku), který jste odtrhli pinzetou z mechové rostlinky. Přikápněte malou kapku akriridinové oranže, přikryjte krycím sklíčkem a pozorujte pod fluorescenčním mikroskopem. Zakreslete.

3. Pozorování řas s využitím autofluorescence i fluorescenčního barvení

Z připravených vzorků stojatých a tekoucích vod zhotovujte preparáty se zástupci řas a pozorujte je pod flurescenčním mikroskopem. Některé povedené preparáty pak dobarvěte akridinovou oranží – k jedné hraně krycího sklíčka kápněte malou kapku barviva a z druhé strany filtračním papírem odsávejte vodu – barvivo se nasaje do preparátu a obarví vzorek. Zakreslujte pozorovaní zástupce řas a všímejte si, jaké struktury v jejich buňkách mají autofluorescenci a jaké se výrazně barví oranží.

Výsledky pozorování

Většina pylových zrn má výraznou autofluorescenci. Některá zrna svítí po celém povrchu stejnoměrně – např. smrk (na zrnech jsou také velmi dobře vidět vzdušné vaky umožňující šíření pylových zrn větrem), u jiných svítí některé části intenzivněji než jiné (u trojhranných zrn svíčkovce svítí středová část trojúhelníku výrazně víc než jeho vrcholy – špičky).

Při pozorování pokožky cibule v barveném preparátu vidíme nevýrazně obarvené buněčné stěny a výrazně probarvená jádra. Jádra jsou uložená u stěny a mají laločnatý tvar. V lístku rašeliníku se oranží zvýraznily buněčné stěny, lístek připomíná vzhledem krajku.

Při pozorování řas si všimneme, že bez použití barviva svítí červeně ty části řas, které obsahují chlorofyl – tj. chloroplasty různých tvarů. Při použití fluorescenčního barviva se obarví a zvýrazní zejména buněčná stěna a cytoplazma.

Metodické poznámky a doporučení

Fotografie z fluorescenčního mikroskopu jsme pořídili na přístroji zapůjčeném z PřF UK v Praze. Mikroskop byl pořízen z prostředků MŠMT v rámci grantu, jehož řešitelem byla katedra buněčné biologie PřF UK, a je nabízen k zapůjčení středním školám. Více informací najdete zde.
Cílem těchto úloh je nabídnout pár námětů k tomu, co pozorovat, pokud se s žáky dostaneme k fluorescenčnímu mikroskopu. Většina námětů je podrobněji popsaná v jiných úlohách naší databáze. Postup přípravy preparátů je zde proto poněkud zestručněn a důraz je v návodu kladen pouze na nový prvek – užití flurescenčního mikroskopu, event. fluorescenční barvení.
Z hlediska ročního období lze úlohu zařadit kdykoliv, protože můžeme použít libovolné druhy pylů, řasy např. z akvária a cibule a mechy (také libovolné) jsou dostupné po celý rok.
Při barvení akridinovou oranží přidáváme k preparátům opravdu malé kapky barviva. Pokud dáme barviva příliš, je preparát přebarvený a celé zorné pole je výrazně zbarvené (do zelena či do žluta) a objekty se v něm ztrácejí.
Práce s fluorescenčním mikroskopem je pro žáky zajímavým zpestřením.
Další náměty pro pozorování objektů ve fluorescenčním mikrsokopu přináší úloha 120.
Zajímavými objekty pro pozorování jsou i některé organismy z živočišné říše. Pozorovat lze různé drobné zástupce hmyzu nebo např. šupiny z motýlích křídel.
Úloha je zařazena mezi „materiálově náročné“, i když pracuje s běžně dostupným rostlinným materiálem. Důvodem tohoto zařazení je to, že úloha vyžaduje užití fluorescenčního mikroskopu, který není pro většinu škol zařízením běžně dostupným.

Obrazová dokumentace


Nahoře: Svíčkovec (Gaura sp.); dole: Smrk (Picea sp.) – Pylová zrna. Vitální preparát bez vody – autofluorescence. Vhodné zvětšení pro pozorování 100 – 200×.	1 – pylové zrno; 2 – vzdušné vaky pylového zrna


Vlevo a pravo nahoře: Cibule (Allium sp.) – Zvýrazněná jádra v prozenchymu vnitřní pokožky suknice; vpravo dole – Rašeliník (Sphagnum sp.) – Lístek. Vitální preparát, fluorescenční barvení – barveno akridinovou oranží. Vhodné zvětšení pro pozorování 100 – 200×.	A; B – pletivo prozenchym s jádry; C – lístek mechu; 1 – buněčná stěna; 2 – cytoplazma; 3 – jádro


Zelené řasy (Chlorophyta) – Různí zástupci. Vlevo – vitální preparát, fluorescenční barvení akridinovou oranží; vpravo vitální preparát ve vodě – autoflurescence. Vhodné zvětšení pro pozorování 100 – 200×.	A; B – šroubatka ; C – zelená řasa – Pediastrum sp.; D; G – řasa spájivka – Closterium sp.; E; F – rozsivky; H – obrněnka – Ceratium sp.; I – zelená koloniální řasa – váleč