117. Bakterie IV. - Gramovo barvení a imerzní mikroskopie - kultivované bakterie

Parametry úlohy

	Obtížnost:	těžké
	Časová náročnost:	80 minut
	Materiálová náročnost:	náročné
	Druh materiálu:	ostatní
	Čím pozorujeme:	mikroskop
	Téma:	Bakterie a sinice
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Barvení podle Grama je tzv. diagnostické barvení užívané při pozorování bakterií. Diagnostické proto, že pomáhá diagnostikovat – určovat bakterie a zařazovat je do systému. Gramova reakce je založena na reakci některých látek v buněčné stěně bakterií s určitými barvivy. Buněčné stěny některých bakterií obsahují kyselinu teichovou, která po obarvení krystalovou violetí a moření Lugolovým roztokem vytvoří pevný barevný komplex (kyselina, barvivo, jód z IIK), který se nevymývá rozpouštědlem (alkoholem nebo acetonem či jejich směsí). V preparátu mají tyto bakterie barvu krystalové violeti – fialovou až modofialovou. Jsou grampozitivní – G+. Druhá skupina bakterií neobsahuje kyselinu teichovou v buněčné stěně, takže zmíněný komplex se netvoří a modrá violeť se rozpouštědlem vymývá. Po dobarvení světlejším barvivem např. karbolfuchsinem nebo safraninrm se tyto bakterie obarví na růžovo (příp. růžovočerveno). Jsou gramnegativní – G-. Za určitých podmínek (stáří bakteriálních kultur, nevhodné kultivační podmínky apod.) se některé bakterie mohou jevit jako gramlabilní anebo se z grampozitivních mění na gramnegativní. Gramovo barvení je tedy metodou potvrzující, nikoli vyvracející. Jiný výsledek gramova barvení sám o sobě nevyvrátí zařazení druhu do systému, pokud není podpořen dalšími zkouškami, např. biochemickými testy apod.

Imerzní mikroskopie je často používanou metodou v mikrobiologii, kde pozorované objekty mají velmi malé rozměry. Užívá se pro zvýšení rozlišovací schopnosti. Mezi čočku objektivu a pozorovaný objekt se dává imerzní olej (např. oleum cedri = cedrový olej) – kapalina, jejíž index lomu je stejný jako index lomu skla, nedochází proto ke zkreslení tvarů a zvyšuje se ostrost pozorovaných objektů – získáme věrný obraz. U velmi podrobných pozorování se používá dvojitá imerze (imerzní olej se dává i mezi čočku kondenzoru a sklíčko). Imerzní mikroskopii lze provozovat pouze u mikroskopu, který je vybaven imerzním objektivem (označen jedním, častěji dvěma černými proužky; zvětšení zpravidla 100×).

Pro přípravu většiny barvených preparátů (zvláště při barvení bakterií) je třeba objekty fixovat. Účelem fixace je usmrcení buněk (mrtvé buňky snáze přijímají barvivo) a lepší přilnutí buněk k podkladu, aby nebyly při barvení či oplachování odplaveny. Bakterie fixujeme nejčastěji plamenem.

Nejlepší pro pozorování bakteriálních buněk jsou kultury bakterií vyrostlé na kultivačních půdách. Na rosolovitých agarových plotnách v Petriho miskách jsou pouhým okem patrné kolonie bakterií. Kolonie je skupina buněk vzniklá dělením jedné bakteriální buňky. Kolonie mají různý vzhled (barvu, tvar), který je mimo jiné ovlivněn typem kultivační půdy. Bakterie se na půdu přenáší očkováním, naléváním nebo také např. tzv. „náletem“, kdy pouze necháme misku na několik minut otevřenou a tím na ni dopadnou bakterie ze vzduchu. Při práci s kulturami bakterií dodržujeme zásady aseptické práce.

Materiál

Naočkované Petriho misky s agarovými živnými půdami.

Pomůcky

Mikroskop, podložní a krycí sklíčko, lihový kahan, bakteriologická klička, kapátko, voda, destilovaná voda; barviva a činidla: krystalová violeť, Lugolův roztok, aceton – ethanolová odbarvovací směs, karbolfuchsin nebo safranin, imerzní olej.

Úkoly

Příprava před praktickým cvičením

Zhruba 5 dní před konáním praktického cvičení naočkujte agarové plotny. Na různé půdy lze očkovat kličkou např. mléčné výrobky (sterilní ožehnutou bakteriologickou kličku namočte do jogurtu a na agar kličkou zlehka „nakreslete hada“ a misku opět uzavřete), nebo očkovat pipetou vzorek vody (z řeky, rybníka, vázy s květinami), očkujeme sterilní pipetou, cca 1 ml vzorku. Pipetou očkujeme také např. stěry (vatovou tyčinkou namočenou v destilované vodě setřeme např. povrch desky stolu, či okraj WC, vytřepeme tyčinku ve sterilní zkumavce s destilovanou vodou a pipetou naočkujeme 1 ml na plotnu) a také můžeme očkovat otiskem – na otevřenou půdu otiskneme palec nebo minci, či náletem necháme otevřenou misku položenou několik minut v učebně. Misky pak uchovejte při pokojové teplotě, zabalené např. do alobalu.

1. Pozorování bakterií mléčného kvašení v preparátu barveném metodou Gramova barvení

Sterilní bakteriologickou kličkou odeberte vzorek kolonie z půdy s naočkovaným jogurtem a přeneste jej do kapky vody na podložním sklíčku. Pomocí kličky vzorek v kapce rozmíchejte a rozetřete po ploše sklíčka. Fixujte plamenem – to znamená, že několikrát protáhnete sklíčko s rozetřeným preparátem těsně nad hořícím plamenem kahanu, a to vzorkem nahoru, nikoliv do plamenu (sklíčko se nesmí příliš zahřát, protože vzorek nesmí být připálený – protahujte rychle a mezi jednotivými protaženími chvilku počkejte, za fixovaný považujte preparát, ze kterého se působením tepla plamenu odpařila voda – tzn. že sklíčko je suché a je na něm vidět zaschlý vzorek). Preparát nyní obarvěte následujícím postupem: kápněte kapku krystalové violeti a nechte působit 20 sekund. Bez opláchnutí přikápněte kapku Lugolova roztoku, který slijte i s původním barvivem (violetí) a hned poté znovu nakapte dostatečné množství Lugolova roztoku a nechte působit 20 – 30 sekund. Následně preparát odbarvěte aceton-ethanolovou směsí (použijte pipetu, odbarvovací směs lijte opatrně na zešikmené sklíčko nad nátěr, přes preparát nechejte volně stékat a opakujte, dokud je zřejmé, že se barvivo vymývá – tedy stékající tekutina je obarvená) a dobře opláchněte vodou (stříčkou nebo pipetou, stejný postup opatrně jako při odbarvování). Preparát pak ještě dobarvěte zředěným karbolfuchsinem (event. safraninem) 30 – 60 sekund. Nakonec preparát znovu opláchněte a nechte oschnout či opatrně osušte filtračním papírem. Připravený preparát pozorujte s použitím imerze: Na obarvený suchý preparát bez krycího sklíčka kápněte kapku cedrového oleje. Preparát umístěte na stolek mikroskopu a zvolte imerzní objektiv! Opatrně přibližujte objektiv, až čočku namočíte do kapky oleje (sledujte ze strany, dávejte si pozor na proražení sklíčka!). Během pohlížení do okuláru oddalujte velmi pomalu mikrošroubem objektiv. Sloupec kapaliny oleje mezi sklíčkem a čočkou se nesmí přerušit. Pokud jste objektiv příliš oddálili, postup opakujte (nikdy nepřibližujte objektiv při pohlížení do okuláru, vždy kontrolujte pohledem z boku). Zakreslete tvary pozorovaných bakterií, zaznamenejte, zda jsou modré (grampozitivní), nebo růžové/červené (gram negativní). Ke svému nákresu si také poznamenejte makroskopický vzhled kolonie, kterou jste k vytvoření vzorku použili (barvu, velikost, povrch apod.). Po skončení pozorování dobře očistěte objektiv, případně i stolek mikroskopu a kondenzor roztokem ethanolu. Stejně tak i sklíčka.

2. Pozorování koliformních bakterií v preparátu barveném metodou Gramova barvení

Z misky, na kterou jste naočkovali stěr z WC, odeberte vzorek z vyrostlé kolonie a přeneste jej do kapky vody na podložním sklíčku. Rozetřete, fixujte plamenem, barvěte podle Grama a pozorujte v imerzi. Zakreslete tvary pozorovaných bakterií, zaznamenejte, zda jsou modré (grampozitivní), nebo růžové/červené (gramnegativní). Ke svému nákresu si také poznamenejte makroskopický vzhled kolonie, kterou jste k vytvoření vzorku použili (barvu, velikost, povrch apod.). Po skončení pozorování dobře očistěte objektiv, případně i stolek mikroskopu a kondenzor roztokem ethanolu. Stejně tak i sklíčka.

3. Pozorování vodních bakterií v preparátu barveném metodou Gramova barvení

Z misky, na kterou jste naočkovali vzorek vody z řeky nebo rybníka, odeberte vzorek z vyrostlé kolonie a přeneste jej do kapky vody na podložním sklíčku. Rozetřete, fixujte plamenem, barvěte podle Grama a pozorujte v imerzi. Zakreslete tvary pozorovaných bakterií, zaznamenejte, zda jsou modré (grampozitivní), nebo růžové/červené (gram negativní). Ke svému nákresu si také poznamenejte makroskopický vzhled kolonie, kterou jste k vytvoření vzorku použili (barvu, velikost, povrch apod.). Po skončení pozorování dobře očistěte objektiv, případně i stolek mikroskopu a kondenzor roztokem ethanolu. Stejně tak i sklíčka.

Výsledky pozorování

Ve vzorku z jogurtu pozorujeme pouze grampozitivní bakterie. Jedná se o G+ tyčinky (pravděpodobně rod Lactobacillus sp.) a koky, které se sdružují do dvojic nebo krátkých řetízků. Může jít např. o zástupce mlékařských bakterií Streptococcuc cremoris nebo S. lactis. Ve stěru z WC nalezneme mnoho gramnegativních, většinou drobných tyčinek. S největší pravděpodobností jde o zástupce tzv. enterobakterií – tj. bakterií ze střevního obsahu člověka. Těmto bakteriím také říkáme bakterie koliformní, nejznámějším zástupcem je druh Escherichia coli. Vzorek s Lužnice obsahuje směs grampozitivních a gramnegativních bakterií. Při pouhém pohledu do mikroskopu nelze zástupce blíže určit.

Metodické poznámky a doporučení

Cvičení je náročné jak z hlediska přípravy materiálu, tak i z hlediska vlastní práce. Doporučujeme zařazovat toto cvičení jen pro žáky/studenty, kteří mají s běžnou mikroskopií již nějaké zkušenosti.
Misky s agarem je nejlepší získat prostřednictvím kontaktu v některé z mikrobiologických laboratoří v blízkosti školy. Připravit sterilní půdu v podmínkách školy je zpravidla neproveditelné. Je také možné koupit od distributora již hotovou sterilní agarovou půdu a tu jen rozehřát a do vysterilizovaných misek rozlít.
Mnemotechnická pomůcka pro snadnější zapamatování si postupu gramova barvení: VLAK = Violeť – Lugol – Aceton-alkohol – Karbolfuchsin; příp. VLAS = Violeť – Lugol – Aceton-alkohol – Safranin.
Mezi časté chyby patří příliš husté preparáty, nedostatečné vymytí barviva, nedostatečné osvětlení zorného pole (pracujeme s velkým zvětšením, kondenzor musí být v maximální horní poloze) a také příliš „hrubé“ zaostřování – zaostřování makrošroubem, či příliš rychle mikrošroubem, zaostření objektu naše oko nepostřehne. Postup je třeba trpělivě opakovat.
Zdůrazníme žákům, aby pro pozorování v imerzi používali pouze imerzní objektiv.
Poučíme také žáky o riziku rozbití skla tlakem objektivu (při nepozornosti a zejména u nezkušených pozorovatelů se stává, že žáci při přibližování objektivu ke sklu použitím přílišné síly sklo objektivem rozdrtí).
„Atraktivním“ objektem pozorování bývají pro žáky krystalky krystalové violeti (vějířovité shluky tenkých jehlicovitých krystalů), mnoho žáků při hledání správného objektu zaujmou.
Před zahájením práce provedeme rozšiřujícíc poučení o bezpečnosti práce a poučíme o zásadách aseptické práce. Po skončení praktika misky zlikvidujeme. Vzhledem k tomu, že většina škol nemá autokláv či jiné zařízení k bezpečné likvidaci kultur, doporučujeme jako dostačující likvidaci pomocí prostředku SAVO. Otevřené misky zalijeme nezředěným SAVEM a necháme několik minut působit. Pak s použitím rukavic vzorky vyškrábneme a můžeme vylít např. do WC. jednorázové misky vyhodíme sklenění omyjeme v horké vodě s jarem.
Upozorníme žáky na riziko zašpinění oděvu při práci s barvivy, raději vyžadujeme použití pracovních plášťů nebo jiných odhranných oděvů.
Vedeme žáky k tomu aby po skončení práce důkladně omyli podložní sklíčka a důsledně z nich odstranili zbytky barviv a imerzního oleje. Většinou je nezbytné k dobrému odstranění barviv a zbytků oleje (ze skel, ale také např ze stolků mikroskopů či pracovních stolů v laboratoři) použít např. ethanol.
Další náměty pro pozorování bakterií obsahují úlohy 114, 115, 116.

Zásady aseptické práce

Práce v místnosti, kde není průvan a nevíří se prach.
Ruce si před prací omýt mýdlem příp. i desinfekčním prostředkem, stejně tak po skončení práce.
Povrch pracovní plochy před prací i po skončení vydesinfikovat, pracovat blízko plamene a před počátkem práce ještě plamen několikrát protáhnout pracovním prostorem.
Pracovat sice opatrně, ale co nejrychleji.
Nástroje (např. bakteriologickou kličku) před a po práci ožehnout plamenem.
Nádoby s kulturou nebo sterilní roztoky a misky s půdami nechávat otevřené jen po skutečně nezbytnou dobu a pracovat blízko plamene.
Přísně dodržování běžných pravidel osobní hygieny. Nehty musí být krátké, je-li nutné je třeba používat pokrývku vlasů (příp. vousů).
V laboratořích se nesmí pít, jíst ani kouřit.
Při očkování ploten nebo zkumavek se nesmí mluvit, kašlat apod.

Obrazová dokumentace


G+ mléčného kvašení (Lactobacillus sp.; Streptococcus sp.) – Grampozitivní tyčinky a koky. Vzorek z kolonie kultivované na agaru naočkovaném jogurtem. Fixovaný preparát. Barveno podle Grama; Pozorováno v imerzi. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 100/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – diplokok (modrý = G+); 2 – tyčinka – bacil (modrá = G+)


G- koliformní bakterie (Enterobacteriaceae sp.) – Gramnegativní tyčinky. Vzorek z kolonie kultivované na agaru naočkovaném stěrem z WC. Fixovaný preparát. Barveno podle Grama; Pozorováno v imerzi. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 100/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – tyčinka (růžová = G-); 2 – spóra


G- a G+ vodní bakterie (Bacteria sp.) – Grampozitivní stafylokoky a tyčinky; gramnegativní tyčinky. Vzorek z kolonie kultivované na agaru naočkovaném vodou z Lužnice. Fixovaný preparát. Barveno podle Grama; Pozorováno v imerzi. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 100/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – stafylokok (modrý = G+); 2 – tyčinka – bacil (modrá = G+); 3 – tyčinka (růžová = G-)