116. Bakterie III. - Gramovo barvení a imerzní mikroskopie

Parametry úlohy

	Obtížnost:	těžké
	Časová náročnost:	80 minut
	Materiálová náročnost:	středně náročné
	Druh materiálu:	ostatní
	Čím pozorujeme:	mikroskop
	Téma:	Bakterie a sinice
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Barvení podle Grama je tzv. diagnostické barvení, to znamená, že pomáhá diagnostikovat – určovat bakterie a zařazovat je do systému. Gramova reakce je založena na reakci některých látek v buněčné stěně bakterií s určitými barvivy. Buněčné stěny některých bakterií obsahují kyselinu teichovou, která po obarvení krystalovou violetí a moření Lugolovým roztokem vytvoří pevný barevný komplex (kyselina, barvivo, jód z IIK), který se nevymývá rozpouštědlem (alkoholem nebo acetonem či jejich směsí). V preparátu mají tyto bakterie barvu krystalové violeti – fialovou až modofialovou. Jsou grampozitivní – G+. Druhá skupina bakterií neobsahuje kyselinu teichovou v buněčné stěně, takže zmíněný komplex se netvoří a modrá violeť se rozpouštědlem vymývá. Po dobarvení světlejším barvivem např. karbolfuchsinem nebo safraninem se tyto bakterie obarví na růžovo (příp. růžovočerveno). Jsou gramnegativní – G-. Za určitých podmínek (stáří bakteriálních kultur, nevhodné kultivační podmínky apod.) se některé bakterie mohou jevit jako gramlabilní anebo se z grampozitivních mění na gramnegativní. Gramovo barvení je tedy metodou potvrzující, nikoli vyvracející. Jiný výsledek gramova barvení sám o sobě nevyvrátí zařazení druhu do systému, pokud není podpořen dalšími zkouškami, např. biochemickými testy apod.

Imerzní mikroskopie je často používanou metodou v mikrobiologii, kde pozorované objekty mají velmi malé rozměry. Užívá se pro zvýšení rozlišovací schopnosti. Mezi čočku objektivu a pozorovaný objekt se dává imerzní olej (např. oleum cedri = cedrový olej) – kapalina, jejíž index lomu je stejný jako index lomu skla, nedochází proto ke zkreslení tvarů a zvyšuje se ostrost pozorovaných objektů – získáme věrný obraz. U velmi podrobných pozorování se používá dvojitá imerze (imerzní olej se dává i mezi čočku kondenzoru a sklíčko). Imerzní mikroskopii lze provozovat pouze u mikroskopu, který je vybaven imerzním objektivem (označen jedním, častěji dvěma černými proužky; zvětšení zpravidla 100×).

Pro přípravu většiny barvených preparátů (zvláště při barvení bakterií) je třeba objekty fixovat. Účelem fixace je usmrcení buněk (mrtvé buňky snáze přijímají barvivo) a lepší přilnutí buněk k podkladu, aby nebyly při barvení či oplachování odplaveny. Bakterie fixujeme nejčastěji plamenem.

Materiál

Bílý jogurt s živou jogurtovou kulturou, případně kyselé mléko, kefír, zakysaná smetana či jiný mléčný výrobek obsahující bakterie mléčného kvašení; senný nálev založený cca 2 týdny před praktickým cvičením; brambora v anaerobním rozkladu (založeno cca týden před praktickým cvičením).

Pomůcky

Mikroskop, podložní a krycí sklíčko, lihový kahan, bakteriologická klička, kapátko, voda; barviva a činidla: krystalová violeť, lugolův roztok, aceton – ethanolová odbarvovací směs, karbolfuchsin nebo safranin, imerzní olej.

Úkoly

Příprava před praktickým cvičením

Zhruba dva týdny před konáním praktického cvičení dejte do sklenice hrst sena a zalijte jí vodou z rybníka, potoka nebo sudu (ne chlorovanou vodou z vodovodu). Senný nálev nechte stát při pokojové teplotě. Na povrchu nálevu se vytvoří bakteriální blanka.
Zhruba týden před praktickým cvičením připravíme bramboru – do středně vělké omyté brambory vyvrtáme (vyřízeme) otvor a naplníme jej zahradní zeminou. Takto upravenou bramboru dáme do zavařovací lahve nebo větší kádinky, nádobu naplníme až po okraj vodou a necháme stát v teple (např. při pokojové teplotě). V průběhu několika dní můžeme pozorovat tvorbu plynu: na hladině se utváří bakteriální blanka, brambor po několika dnech vyplave k hladině a páchne. Rozklad bramboru zapříčila anaerobní bakterie Clostiridium butyricum, která by měla být převažujícím druhem při pozorování.
3 – 4 dny necháme vzorek kravského mléka stát v teple, aby mléko zkyslo (pro kysnutí je nutné používat mléko získané přímo od krávy, mléka s dlouhou trvanlivostí prodávaná např. v krabicích schopnost pravého kysnutí ztrácejí).

1. Pozorování bakterií mléčného kvašení v preparátu barveném metodou Gramova barvení

Z jogurtu či jiného mléčného výrobku, případně zkyslého mléka odeberte vyžíhanou bakteriální kličkou vzorek a přeneste jej do kapky vody na podložním sklíčku. Pomocí kličky vzorek v kapce rozmíchejte a rozetřete po ploše sklíčka. Fixujte plamenem – to znamená, že několikrát protáhnete sklíčko s rozetřeným preparátem těsně nad hořícím plamenem kahanu a to vzorkem nahoru nikoliv do plamenu (sklíčko se nesmí příliš zahřát, protože vzorek nesmí být připálený – protahujte rychle a mezi jednotivými protaženími chvilku počkejte, za fixovaný považujte preparát, ze kterého se působením tepla plamenu odpařila voda, tzn. že sklíčko je suché a je na něm vidět zaschlý vzorek). Preparát nyní obarvěte následujícím postupem: kápněte kapku krystalové violeti a nechte působit 20 sekund. Bez opláchnutí přikápněte kapku Lugolova roztoku, který slijte i s původním barvivem (violetí) a hned poté znovu nakapte dostatečné množství Lugolova roztoku a nechte působit 20 – 30 sekund. Následně preparát odbarvujte aceton-ethanolovou směsí (pipetou, odbarvovací směs lijte opatrně na zešikmené sklíčko nad nátěr, přes preparát nechejte volně stékat a opakujte, dokud je zřejmé, že se barvivo vymývá – tedy stékající tekutina je obarvená) a dobře opláchněte vodou (stříčkou nebo pipetou, proveďte opatrně stejný postup jako při odbarvování). Preparát pak ještě dobarvěte zředěným karbolfuchsinem (event. safraninem) 30 – 60 sekund. Nakonec preparát znovu opláchněte a nechte oschnout či opatrně osušte filtračním papírem. Připravený preparát pozorujte s použitím imerze: Na obarvený suchý preparát bez krycího sklíčka kápněte kapku cedrového oleje; preparát umístěte na stolek mikroskopu a zvolte imerzní objektiv! Opatrně přibližujte objektiv, až čočku namočíte do kapky oleje (sledujte ze strany, dejte si pozor na proražení sklíčka!). Během pohlížení do okuláru oddalujte velmi pomalu mikrošroubem objektiv. Sloupec kapaliny oleje mezi sklíčkem a čočkou se nesmí přerušit. Pokud jste objektiv příliš oddálili, opakujte postup (nikdy nepřibližujte objektiv při pohlížení do okuláru, vždy kontrolujte pohledem z boku). Zakreslete tvary pozorovaných bakterií, zaznamenejte, zda jsou modré (grampozitivní), nebo růžové/červené (gramnegativní). Po skončení pozorování dobře očistěte objektiv, případně i stolek mikroskopu a kondenzor roztokem ethanolu. Stejně tak i sklíčka.

2. Pozorování bakterií máselného kvašení v preparátu barveném metodou Gramova barvení

Ze spodní strany povrchové blanky vytvořené ve sklenici s hnijícím bramborem odeberte bakteriologickou kličkou vzorek a přeneste jej do kapky vody na podložním sklíčku. Rozetřete, fixujte plamenem, barvěte podle Grama a pozorujte v imerzi. Zakreslete tvary pozorovaných bakterií, zaznamenejte, zda jsou modré (grampozitivní), nebo růžové/červené (gram negativní). Po skončení pozorování dobře očistěte objektiv, případně i stolek mikroskopu a kondenzor roztokem ethanolu. Stejně tak i sklíčka.

3. Pozorování bakterií ze senného nálevu v preparátu barveném metodou Gramova barvení

Z povrchové blanky vytvořené ve sklenici se senným nálevem odeberte bakteriologickou kličkou vzorek a přeneste jej do kapky vody na podložním sklíčku. Rozetřete, fixujte plamenem, barvěte podle Grama a pozorujte v imerzi. Zakreslete tvary pozorovaných bakterií, zaznamenejte, zda jsou modré (grampozitivní), nebo růžové/červené (gram negativní). Po skončení pozorování dobře očistěte objektiv, případně i stolek mikroskopu a kondenzor roztokem ethanolu. Stejně tak i sklíčka.

Výsledky pozorování

V preparátu získaném z jogurtu či jiného mléčného výrobku pozorujeme bakterie modré. Všechny mléčné bakterie, které se používají v mlékárenském průmyslu, jsou grampozitivní. Na obrázcích je vidět koky, diplokoky, streptokoky i tyčinky (bacily). Na naší fotografii vpravo jsou bakterie spíš fialové než modré (pravděpodobně nedošlo k dostatečnému vymytí karbolfuchsinu). V preparátu z bramboru jsme našli tyčinky obarvené do modra – grampozitivní. V některých tyčinkách je zřetelně vidět bílé oválné spóry. Umístění spór na jednom konci buňky je typické pro bakterie rodu Clostridium. Na obrázku jsou pak vidět i růžové – gramnegativní buňky zcela vyplněné spórami. V preparátu ze senného nálevu převažují bakterie gramnegativní, většinou tyčinkovité, v menší míře lze pozorovat i grampozitivní kulovité buňky (koky, střeptokoky) nebo tyčinky.

Metodické poznámky a doporučení

Cvičení je náročné jak z hlediska přípravy materiálu, tak i z hlediska vlastní práce. Doporučujeme zařazovat toto cvičení jen pro žáky/studenty, kteří mají s běžnou mikroskopií již nějaké zkušenosti.
Mnemotechnická pomůcka pro snadnější zapamatování si postupu gramova barvení: VLAK = Violeť – Lugol – Aceton-alkohol – Karbolfuchsin; příp. VLAS = Violeť – Lugol – Aceton-alkohol – Safranin.
Pro žáky nebývá jednoduché najít v mikroskopu správný objekt. Nejčastější příčinou neúspěchu je příliš hustý preparát (málo rozetřený, silná vrstva vzorku) nebo preparát nedostatečně vymytý tj. obsahuje příliš silnou vrstvu barviva a nelze jej prosvítit. Také se setkáme s preparáty „příliš dobře fixovanými“, tedy připálenými.
Mezi další chyby patří nedostatečné osvětlení zorného pole (pracujeme s velkým zvětšením, kondenzor musí být v maximální horní poloze) a také příliš „hrubé“ zaostřování – zaostřování makrošroubem či příliš rychle mikrošroubem, zaostření objektu naše oko nepostřehne. Postup je třeba trpělivě opakovat.
Zdůrazníme žákům, aby pro pozorování v imerzi používali pouze imerzní objektiv.
Poučíme také žáky o riziku rozbití skla tlakem objektivu (při nepozornosti a zejména u nezkušených pozorovatelů se stává, že žáci při přibližování objektivu ke sklu použitím přílišné síly sklo objektivem rozdrtí).
„Atraktivním“ objektem pozorování bývají pro žáky krystalky krystalové violeti (vějířovité shluky tenkých jehlicovitých krystalů). Mnoho žáků při hledání správného objektu zaujmou.
V různých mléčných výrobcích je obsaženo rozdílné množství (i rozdílné tvary buněk) bakterií.
Upozorníme žáky na riziko zašpinění oděvu při práci s barvivy, raději vyžadujeme použití pracovních plášťů nebo jiných ochranných oděvů.
Vedeme žáky k tomu, aby po skončení práce důkladně omyli podložní sklíčka a důsledně z nich odstranili zbytky barviv a imerzního oleje. Většinou je nezbytné k dobrému odstranění barviv a zbytků oleje (ze skel, ale také např. ze stolků mikroskopů či pracovních stolů v laboratoři) použít např. ethanol.
Další náměty pro pozorování bakterií obsahují úlohy 114, 115 a 117.

Obrazová dokumentace


Bakterie mléčného kvašení (Lactobacillus sp.; Streptococcus sp.) – Grampozitivní tyčinky a koky. Vlevo a uprostřed: Jogurt Activia; Vpravo: kyselé kravské mléko. Fixovaný preparát. Barveno podle Grama; Pozorováno v imerzi. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 100/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – streptokok (modrý = G+); 2 – diplokok (modrý = G+); 3 – tyčinka – bacil (modrá = G+)


Bakterie máselného kvašení (Clostridium butyricum) – Grampozitivní i gram negativní tyčinky se spórami. Fixovaný preparát. Barveno podle Grama; Pozorováno v imerzi. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 100/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – tyčinka (modrá = G+); 2 – krátká tyčinka (růžová = G-); 3 – spóra


Bakterie senného nálevu (Bacteria) – Grampozitivní i gram negativní tyčinky a koky. Fixovaný preparát. Barveno podle Grama; Pozorováno v imerzi. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 100/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – tyčinka (růžová = G-); 2 – streptokok (modrý = G+); 3 – tyčinka (modrá = G+); 4 – diplokok (modrý = G+); 5 – spóra