115. Bakterie II. - jednoduché a negativní barvení

Parametry úlohy

	Obtížnost:	středně těžké
	Časová náročnost:	60 minut
	Materiálová náročnost:	nenáročné
	Druh materiálu:	ostatní
	Čím pozorujeme:	mikroskop
	Téma:	Bakterie a sinice
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Bakterie jsou nejrozšířenější skupina organismů na světě. Je možno je nalézt v půdě, ovzduší, ve vodě, jako symbionty uvnitř i na povrchu těla mnohobuněčných organismů. Jsou mezi nimi druhy osidlující extrémní prostředí – sopečná vřídla, led, nejvyšší vrstvy atmosféry apod.

Tělo bakterií tvoří prokaryotická buňka – tedy buňka jednoduchá, tvořená buněčnou stěnou z mureinu neboli peptidoglykanu. Uvnitř základní plazmy je nukleoid – jaderná hmota, kterou tvoří jeden chromozom neohraničený jadernou membránou. Dalším znakem jsou volné malé kruhové molekuly DNA plazmidy. Na povrchu bakterií může být ještě slizová vrstva, slizové pouzdro – kapsula, případně nebo cukerná ochranná vrstva – glykokalyx, umožňující např. patogenním bakteriím vazbu na hostitelskou buňku, některé bakterie mohou mít jeden nebo více bičíků umožňující pohyb. Další strukturou jsou fimbrie, což jsou vlákna umožňující přilnavost patogenních bakterií např. ke sliznici a také předávání plazmidů mezi buňkami bakterií. Bakterie se rozmnožují přímým dělením. Některé tvoří odolné klidové útvary – spory.

Tvar bakterií je kulovitý, tyčkovitý, vláknitý a někdy tvoří útvary podobné podhoubí. Buňky jsou buď jednotlivé, nebo tvoří kolonie s určitým počtem buněk.

Kulovité jsou koky a tvoří dvojice – diplokoky, čtveřice tetrakoky, řetízky streptokoky, hrozny – stafylokoky a balíčky – sarciny.
Tyčkovité jsou bacily a tvoří diplobacily, streptobacily a palisádové bacily.
Další druh tyček kolonie netvoří a jsou to tyčky mírně zahnuté – vibria, tyčky zvlněné – spirily a tyčky spirálové – spirochety.

A protože se stavba buněčné stěny a dalších obalů u různých bakterií liší a jsou to látky, které dobře přijímají barviva, využívá se této vlastnosti k barvení bakterií a tím jejich rozlišování.

Mezi základní metody barvení patří mimo jiné:

Jednoduché barvení – využívá schopnosti živých buněk přijímat bez poškození některá barviva.
Negativní barvení – využívá pozorování bakterií v tušovém zástinu.
Barvení podle Grama – tzv. diagnostické barvení – využívá rozdílností ve stavbě stěn bakterií a tím schopnost obarvit nebo neobarvit se různým typem barviva. Pozorování bakterií barvených podle Grama se věnují jiné úlohy (116 a 117).

Ústní dutina pro svoje teplé a vlhké prostředí je vhodným místem pro výskyt bakterií. Bakterie zde tvoří přirozenou mikrofloru. Zároveň jsou ústa vstupní brannou pro průnik patogenních bakterií do těla. Mikroflora je závislá na stavu zubů a samozřejmě na hygieně ústní dutiny. Na povrchu zubů se tvoří tenký pevně přisedlý film, který nelze úplně odstranit ani dokonalým čistěním zubů. Tento film obsahuje hlavně vláknité bakterie, které zkvašují cukry. Kromě nich jsou tam bakterie různých jiných tvarů – koky, tyčky a další.

Povrchová blanka na močůvce je tvořena téměř výhradně vláknitými zvlněnými buňkami bakterie Spirillum volutans. Bakterie v močůvce fungují jako rozkladači organických látek.

Materiál

Zubní plak setřený ze zadních stoliček, zředěná močůvka (nejlépe od vepřů).

Pomůcky

Mikroskop, podložní a krycí sklíčko, lihový kahan, bakteriální klička, párátka, karbolfuchsin a methylenová modř, černá tuš.

Úkoly

1. Pozorování bakterií zubního hlenu obarvených metodou negativního barvení

Setřete tupou hranou párátka bílý povlak ze zubů. Na čisté podložní sklíčko kápněte kapku vody a malou kapku tuše a do nich párátkem rozetřete získaný zubní hlen. Nechte zaschnout na vzduchu a po zaschnutí pozorujte na největším zvětšení. Tvary bakterií nakreslete.

2. Pozorování bakterií zubního hlenu obarvených metodou jednoduchého barvení

Opět setřete hlen ze zubů a rozetřete párátkem v kapce vody na čisté podložní sklíčko. Fixujte plamenem – to znamená, že několikrát protáhnete sklíčko s rozetřeným preparátem těsně nad hořícím plamenem kahanu a to vzorkem nahoru nikoliv do plamenu (sklíčko se nesmí příliš zahřát, protože vzorek nesmí být připálený; protahujte rychle a mezi jednotivými protaženími chvilku počkejte, za fixovaný považujte preparát, ze kterého se působením tepla plamenu odpařila voda – tzn. že sklíčko je suché a je na něm vidět zaschlý vzorek). Obarvěte karbolfuchsinem tak, že na suchý preparát kápnete kapku barviva. Po chvíli přebytečné barvivo opláchněte slabým proudem vody (s použítím stříčky nebo slabého proudu vody z kohoutku postupujeme tak, že necháme vodu dopadat na horní stranu šikmo drženého sklíčka – voda stéká přes obarvený preparát dolů a odnáší přebytečné barvivo. Pokud necháte dopadat proud vody přímo na vzorek, hrozí vymytí samotného vzorku). Druhý stejně připravený preparát (roztěr, fixovaný plamenem) obarvěte methylenovou modří, oba preparáty nechte zaschnout na vzduchu a pozorujete bez krycího skla na největší zvětšení. Zakreslete tvary bakterií.

3. Pozorování šroubovitých bakterií Spirillum volutans z močůvky

Bakteroální kličkou naberte blanku, která se vytvořila na povrchu močůvky, přeneste do kapky vody na čistém podložním sklíčku a očkem rozetřete po povrchu sklíčka. Vzorek fixujte plamenem a obarvěte karbolfuchsinem nebo methylenovou modří (postup fixace a barvení preparátu viz úkol č. 2). Mikroskopujte při největším zvětšení. Tvary bakterií nakreslete.

Výsledky pozorování

V tušovém preparátu jsme rozeznali vláknité bakterie jako světlé čárky na tmavém podkladu.
Obarvené preparáty zvýraznily červeně a modře různé tvary bakterií. Největší množství bylo bakterií vláknitých.
Bakterie z močůvky se barvivy obarvily modře a červeně, a přesto si zachovaly spirálovitý tvar. Pravděpodobně se jedná o běžnou bakterii Spirillum volutans. Pro lepší viditelnost jsme použili pozorování v imerzním oleji při největším zvětšení (obrázek v pravém dolním rohu). Spirily tam vypadají jako zvlněné „žížaly“.

Metodické poznámky a doporučení

Upozorníme žáky na riziko zašpinění oděvu při práci s barvivy, raději vyžadujeme použití pracovních plášťů nebo jiných ochranných oděvů.
Pozorování zubního hlenu někdy žákům připadá neestetické.
Je důležité žákům vysvětlit důležitost hygieny úst a zubů a ukázat jim, že i při dobrém čištění se v plaku bakterie vyskytují.
Na pozorování spiril je nejlepší močůvka od vepřů. Spiril je v ní velké množství, jsou dost velké pro pozorování při běžném zvětšení a jsou viditelné i bez barvení ve vitálním preparátu – v takovém preparátu se bakterie pohybují.
Vedeme žáky k tomu, aby po skončení práce důkladně omyli podložní sklíčka a důsledně z nich odstranili zbytky barviv. Někdy je nezbytné k dobrému odstranění barviv (ze skel, ale také např. ze stolků mikroskopů či pracovních stolů v laboratoři) použít např. ethanol.
Všechny úkoly této úlohy lze použít i pro pozorování s imerzním objektivem. Tuto metodiku přibližují úlohy 116 a 117, pozorování bakterií při běžném zvětšení je pak věnována ještě úloha 114.
Tuš neuvádíme mezi chemickými činidly, nejedná se o chemikálii v pravém slova smyslu, ale o běžně dostupnou psací (výtvarnou) pomůcku, kterou lze koupit v kterémkoliv papírnictví.

Obrazová dokumentace


Bakterie ze zubního plaku – Preparát v tušovém zástinu – negativní barvení. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – vláknitá bakterie; 2 – tyčinkovitá bakterie


Bakterie ze zubního plaku. Fixovaný preparát. Vlevo: obarveno karbolfuchsinem; Vpravo: barveno metylenovou modří. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – vláknitá bakterie; 2 – tyčinkovitá bakterie


Spirillum volutans – Bakterie z močůvky. Fixovaný preparát. Vlevo: barveno karbolfuchsinem; Vpravo nahoře: barveno metylenovou modří. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + Nikon Coolpix L20 Vpravo dole: barveno karbolfuchsinem. Mikroskop LP 3012-T; imerzní objektiv 100/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – spirila (bakterie tvaru vlnovky)