114. Bakterie I. - jednoduché barvení

Parametry úlohy

	Obtížnost:	středně těžké
	Časová náročnost:	60 minut
	Materiálová náročnost:	středně náročné
	Druh materiálu:	ostatní
	Čím pozorujeme:	mikroskop
	Téma:	Bakterie a sinice
	Roční období:	září, říjen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Bakterie jsou nejrozšířenější skupina organismů na světě. Je možno je nalézt v půdě, ovzduší, ve vodě, jako symbionty uvnitř i na povrchu těla mnohobuněčných organismů. Jsou mezi nimi druhy osidlující extrémní prostředí – sopečná vřídla, led, nejvyšší vrstvy atmosféry apod.

Tělo bakterií tvoří prokaryotická buňka – tedy buňka jednoduchá, tvořená buněčnou stěnou z mureinu neboli peptidoglykanu. Uvnitř základní plazmy je nukleoid – jaderná hmota, kterou tvoří jeden chromozom neohraničený jadernou membránou. Dalším znakem jsou volné malé kruhové molekuly DNA plazmidy. Na povrchu bakterií může být ještě slizová vrstva, slizové pouzdro – kapsula, případně cukerná ochranná vrstva – glykokalyx, umožňující např. patogenním bakteriím vazbu na hostitelskou buňku, některé bakterie mohou mít jeden nebo více bičíků umožňující pohyb. Další strukturou jsou fimbrie, což jsou vlákna umožňující přilnavost patogenních bakterií např. ke sliznici a také předávání plazmidů mezi buňkami bakterií. Bakterie se rozmnožují přímým dělením. Některé tvoří odolné klidové útvary – spory.

Tvar bakterií je kulovitý, tyčkovitý, vláknitý a někdy tvoří útvary podobné podhoubí. Buňky jsou buď jednotlivé, nebo tvoří kolonie s určitým počtem buněk.

Kulovité jsou koky a tvoří dvojice – diplokoky, čtveřice tetrakoky, řetízky streptokoky, hrozny – stafylokoky a balíčky – sarciny.
Tyčkovité jsou bacily a tvoří diplobacily, streptobacily a palisádové bacily.
Další druh tyček kolonie netvoří a jsou to tyčky mírně zahnuté – vibria, tyčky zvlněné – spirily a tyčky spirálové – spirochety.

A protože se stavba buněčné stěny a dalších obalů u různých bakterií liší a jsou to látky, které dobře přijímají barviva, využívá se této vlastnosti k barvení bakterií a tím jejich rozlišování.

Mezi základní metody barvení patří mimo jiné:

Jednoduché barvení – využívá schopnosti živých buněk přijímat bez poškození některá barviva.
Negativní barvení – využívá pozorování bakterií v tušovém zástinu.
Barvení podle Grama – tzv. diagnostické barvení – využívá rozdílností ve stavbě stěn bakterií a tím schopnost obarvit nebo neobarvit se různým typem barviva. Pozorování bakterií barvených podle Grama se věnují jiné úlohy (116 a 117).

Senný bacil (Bacillus subtilis) je běžná, hojně rozšířená bakterie, jejíž spóry je možné najít v půdě ve vzduchu i ve vodě. Často způsobuje kontaminace potravin v různých provozech, pro svou odolnost se užívá i k testování horkovzdušných sterilizátorů používaných v laboratořích.

Na kořenech bobovitých rostlin se vytvářejí malé hlízky, v nichž se nacházejí symbiotické bakterie z rodu Rhizobium. Tyto bakterie žijí s rostlinami v symbióze a poskytují jim dusík.

Materiál

Senný nálev – hrstka sena přelitá vodou, nejlépe rybniční nebo dešťová. Sklenici s nálevem necháme několik dní v teple, až se na povrchu vytvoří bakteriální blanka. Hlízky z kořenů bobovitých rostlin – hrachu setého (Pisum sativum) a jetele lučního (Trifolium pratense).

Pomůcky

Mikroskop, podložní a krycí sklíčko, žiletka, preparační jehly, filtrační papír, kapátko, voda, kahan, bakteriální klička, líh, barviva karbolfuchsin a methylenová modř.

Úkoly

1. Pozorování senného bacilu v barvením preparátu

Z předem připraveného senného nálevu stáhněte bakteriální kličkou kousek blanky a přeneste vzorek do kapky vody na podložní sklíčko. Pomocí kličky rozetřete kapku vody se vzorkem nálevu po ploše sklíčka a fixujte plamenem – to znamená, že několikrát protáhnete sklíčko s rozetřeným preparátem těsně nad hořícím plamenem kahanu, a to vzorkem nahoru, nikoliv do plamenu (sklíčko se nesmí příliš zahřát, protože vzorek nesmí být připálený – protahujte rychle a mezi jednotlivými protaženími chvilku počkejte, za fixovaný považujte preparát, ze kterého se působením tepla plamenu odpařila voda, tzn. že sklíčko je suché a je na něm vidět zaschlý vzorek). Obarvěte karbolfuchsinem tak, že na suchý preparát kápnete kapku barviva. Po chvíli přebytečné barvivo opláchněte slabým proudem vody (s použitím stříčky nebo slabého proudu vody z kohoutku postupujeme tak, že necháme vodu dopadat na horní stranu šikmo drženého sklíčka – voda stéká přes obarvený preparát dolů a odnáší přebytečné barvivo; pokud necháte dopadat proud vody přímo na vzorek hrozí vymytí samotného vzorku), necháte zaschnout a pozorujete bez krycího skla na největší zvětšení. Stejným způsobem připravte druhý preparát a obarvěte ho metylenovou modří.

2. Pozorování hlízkovitých bakterií rodu Rhizobium

Vyrýpněte bobovitou rostlinu – nejlépe hrách nebo jetel ze země. Ideální je rostlina kvetoucí. Důkladně omyjte kořeny a odřežte největší hlízky. Opláchněte je v lihu. Na kraji podložního sklíčka hlízku rozřízněte a obsah z ní vymačkejte na sklíčko a rozetřete. Kousky hlízky odstraňte. Fixujte plamenem a obarvěte metylenovou modří podle pokynů v první úloze. Snažte se najít aktivní podobu jinak tyčinkovité bakterie. Aktivní bakterie je hojná u kvetoucích rostlin a má tvar písmene ypsilon. V klidovém stádiu jsou bakterie tyčinkovité. Zjistěte, jestli se od sebe liší hlízky jetele a hrachu.

Výsledky pozorování

Zjistili jsme, že bakteriální blanka na senném nálevu se vytvořila asi za týden. Při pozorování ve 400 násobném zvětšení, jsme objevili velké množství tyčinkovitých bakterií, s největší pravděpodobností jde o senný bacil Bacillus subtilis. Tyčky se barvily karbolfuchsinem do růžova a methylenovou modří do modra.

V roztěru z hlízek hrachu jsme našli tyčkovité bakterie a několik aktivních forem ypsilonového tvaru. Na naší fotografii jsme pro lepší rozlišení použili imerzní objektiv a pozorovali v imerzním oleji. Roztěr z hlízky z kořene jetele byl plný tyčkovitých bakterií. Aktivní Y-formy jsme tam nenašli. V obou případech se s největší pravděpodobností jedná o zástupce rodu Rhizobium.

Metodické poznámky a doporučení

Upozorníme žáky na riziko zašpinění oděvu při práci s barvivy, raději vyžadujeme použití pracovních plášťů nebo jiných ochranných oděvů.
Pozorování seného bacilu je úloha vděčná, v senném nálevu se vždy bakterie najdou a jsou viditelné mikroskopem při běžném zvětšení, jakými je studentský mikroskop vybaven (cca 400 násobné zvětšení).
Před cvičením je nezbytná příprava předem – je nutné jen včas založit senný nálev.
Hlízkovité bakterie lze najít také poměrně snadno, úlohu je vhodnější zařadit v době květu rostlin, kdy narůstá aktivita bakterie, která se projevuje tvorbou ypsilonových forem.
Vedeme žáky k tomu, aby po skončení práce důkladně omyli podložní sklíčka a důsledně z nich odstranili zbytky barviv. Někdy je nezbytné k dobrému odstranění barviv (ze skel, ale také např. ze stolků mikroskopů či pracovních stolů v laboratoři) použít např. ethanol.
Všechny úkoly této úlohy lze použít i pro pozorování s imerzním objektivem. Tuto metodiku přibližují úlohy 116 a 117, pozorování bakterií při běžném zvětšení je pak věnována ještě úloha 115.

Obrazová dokumentace


Senný bacil (Bacillus subtilis) – Bakteriální blanka ze senného nálevu. Fixovaný preparát. Vlevo: barveno karbolfuchsinem; Vpravo: barveno metylenovou modří. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – jednotlivá tyčinka bacilu; 2 – řetízek krátkých tyčinek bacilu


Hlízkové bakterie (Rhizobium) – Hlízka z kořenů hrachu setého. Fixovaný preparát. Vlevo: barveno metylenovou modří. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + Nikon Coolpix L20 Vpravo: barveno metylenovou modří. Mikroskop LP 3012-T; imerzní objektiv 100/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	A; B; – aktivní formy hlízkových bakterií při běžné mikroskopii; C – aktivní formy hlízkových bakterií při imerzní mikroskopii; 1 – větvená buňka tvaru písmene Y


Hlízkové bakterie (Rhizobium) – Hlízka z kořenů jetele lučního. Fixovaný preparát, barveno metylenovou modří. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + kamera CMOS 2	1 – klidové – tyčinkovité formy bakterie