110. Makromycety III. - výtrusy

Parametry úlohy

	Obtížnost:	středně těžké
	Časová náročnost:	30 minut
	Materiálová náročnost:	středně náročné
	Druh materiálu:	ostatní
	Čím pozorujeme:	mikroskop
	Téma:	Houby a lišejníky
	Roční období:	září, říjen, listopad, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Jako makromycety jsou označovány houby, které vytvářejí makroskopické, pouhým okem dobře viditelné plodnice. Do této skupiny patří některé houby vřeckovýtrusné a většina hub stopkovýtrusných.

Stopkovýtrusné houby – bazidiomycety (Basidiomycetes) jsou velmi rozšířenou skupinou hub, zahrnují většinou druhy s makroskopickými plodnicemi, tyto pak řadíme mezi makromycety. Společným znakem všech zástupců této skupiny hub je přítomnost bazidií se sterigmaty (stopečkami), na nichž se vytvářejí výtrusy – bazidiospory (obvykle čtyři na jedné bazidii). Soubor bazidií vytváří na plodnici výtrusorodou vrstvu – rouško (hymenium).

Část plodnice nesoucí rouško se označuje jako nosič rouška – hymenofor, mohou jím být ostny (např. lošák), lišty (např. liška), rourky (např. hřib), lupeny (např. holubinka). Výtrusorodé rouško může být také uloženo na povrchu větviček keříčkovitých plodnic (např. kuřátka) či uvnitř plodnice (např. pestřec). Vedle bazidií se v roušku stopkovýtrusných hub nacházejí také bazidioly – bazidii podobné sterilní buňky v hymeniu a buňky výrazně odlišného tvaru a velikosti, které označujeme jako cystidy.

Výtrusy stopkovýtrusných hub – bazidiospory mají velmi rozmanité tvary – jsou např. kulaté, oválné, elipsoidní, hranaté. Mohou být buď hladké, nebo mají na svém povrchu hrbolky, výběžky, ostny, bradavky, hřebínky, někdy spojené v síť – tyto povrchové struktury se označují jako ornamentika. Tvar, velikost i ornamentika výtrusů jsou důležitým určovacím znakem jednotlivých druhů hub.

Materiál

Suchohřib hnědý (Xerocomus badius), muchomůrka (Amanita sp.), pečárka dvouvýtrusá (Agaricus bisporus), ryzec (Lactarius sp.), pýchavka obecná (Lycoperdon perlatum), pestřec obecný (Scleroderma citrinum), holubinka (Russula).

Pomůcky

Mikroskop, podložní a krycí sklíčko, 2 preparační jehly, žiletka, pinzeta, kapátko, filtrační papír, voda, Melzerovo činidlo, imerzní olej.

Úkoly

1. Mikroskopické pozorování výtrusů stopkovýtrusných hub

Pomocí preparační jehly naberte vypadaný výtrusný prach a přeneste ho do kapky vody na podložní sklíčko a připravte mikroskopický preparát. Pozorujte a zakreslete tvar výtrusů. Povšimněte si také jejich zbarvení a struktury povrchu.

2. Mikroskopické pozorování výtrusů stopkovýtrusných hub – imerzní mikroskopie

Připravte nativní preparát podle návodu v úkolu č. 1 nebo použijte preparát v této úloze zhotovený. Na krycí sklíčko preparátu kápněte kapku imerzního oleje. Preparát umístěte na stolek mikroskopu, zvolte imerzní objektiv (je označen jedním, častěji dvěma černými proužky). Opatrně přibližujte objektiv, až čočku namočíte do kapky oleje (sledujte ze strany, pozor na proražení sklíčka). Za pohlížení do okuláru velmi pomalu mikrošroubem oddalujte objektiv. Sloupec kapaliny oleje mezi sklíčkem a čočkou se nesmí přerušit. Pokud jste objektiv příliš oddálili, postup opakujte (nikdy nepřibližujte objektiv při pohlížení do okuláru, vždy kontrolujte pohledem z boku). Pozorujte a zakreslete tvar, příp. povrchovou strukturu výtrusů.

Po skončení pozorování omyjte objektiv, případně i stolek mikroskopu a kondenzor roztokem ethanolu. Stejně tak i sklíčka.

3. Mikroskopické pozorování výtrusů stopkovýtrusných hub v preparátu barveném Melzerovým činidlem – imerzní mikroskopie

Pro zvýraznění ornamentiky výtrusů (což je jeden z určovacích znaků stopkovýtrusných hub) se často užívá barvení. Pokud je ornamentika výtrusů vytvářena látkami škrobového charakteru, lze tyto struktury obarvit Melzerovým činidlem.

Připravte preparát výtrusů holubinky nebo ryzce podle postupu v úkolu 1. K jedné hraně krycího sklíčka přikápněte pár kapek barviva a filtračním papírem z druhé strany opatrně odsávejte přebytečnou tekutinu – zkontrolujte, že se celý preparát stejnoměrně probarvil, pokud ne, můžete velmi opatrně nadzvednout růžek krycího sklíčka a znovu ho přiklopit).

Tento preparát pozorujte pod imerzí – viz úkol č. 2.

Pozorujte a zakreslete tvar a ornamentiku výtrusů.

Výsledky pozorování

Pozorujeme tvarově i velikostně různé výtrusy. Výtrusy hřibu jsou válcovité až vřetenovité, uprostřed s několika tukovými kapénkami. Výtrusy muchomůrky jsou široce elipsoidní (špička, která je na některých výtrusech zřetelná, je místem, kterým je výtrus přichycený k bazidii), uprostřed s výraznou tukovou kapénkou. Výtrusy žampiónu jsou také široce elipsoidní, mají výraznou žlutohnědou barvu. Na těchto výtrusech nejsou patrné žádné výrazné povrchové struktury.

Povrchové struktury vidíme na výtrusech pestřece, pýchavky, ryzce i holubinky. Výtrusy pestřece jsou hřebínkatě ostnaté, jsou červené a poměrně velké. Mnohem drobnější jsou červenožluté výtrusy pýchavky, mají také méně výraznou ornamentiku. Široce elipsoidní tvar mají výtrusy ryzce i holubinky. Oba druhy mají výraznou ornamentiku, kterou výborně vidíme v preparátu obarveném Melzerovým činidlem.

Metodické poznámky a doporučení

Jeden až dva dny před konáním cvičení položíme klobouky hub výtrusorodou vrstvou na papír a necháme vypadat výtrusy. Studenty upozorníme, že výtrusný prach různých zástupců má různé zbarvení a že toto zbarvení může být také významným diagnostickým znakem.
Při pozorování používejte pouze jedlé druhy hub! V úkolu č. 1 jsou použity výtrusy muchomůrky růžovky.
Hnědočervené zbarvení pozadí dolního obrázku fotografie 3 je způsobeno přítomností Melzerova činidla v preparátu. Ostatní obrázky z fotografie 3 byly pořízeny z preparátu, ze kterého bylo po obarvení barvivo podsátím opět odstraněno a nahrazeno vodou. Odsátí barviva není pro pozorování nezbytné, pokud však tento krok přípravy preparátu uděláme, je výsledný preparát lepší a ornamentika zřetelnější.
Pokud použijeme k pozorování tržní druhy hub, lze úlohu zařadit v kterémkoliv období roku.
Imerzní mikroskopie je často používanou metodou v mikrobiologii, kde pozorované objekty mají velmi malé rozměry. Užívá se pro zvýšení rozlišovací schopnosti. Mezi čočku objektivu a pozorovaný objekt se dává imerzní olej (např. oleum cedri = cedrový olej) – kapalina, jejíž index lomu je stejný jako index lomu skla, nedochází proto ke zkreslení tvarů a zvyšuje se ostrost pozorovaných objektů – získáme věrný obraz. U velmi podrobných pozorování se používá dvojitá imerze (imerzní olej se dává i mezi čočku kondenzoru a sklíčko).
Nejčastější chyby při imerzní mikroskopii: Nedostatečné osvětlení zorného pole (pracujeme s velkým zvětšením, kondenzor musí být v maximální horní poloze); příliš „hrubé“ zaostřování – zaostřování makrošroubem, či příliš rychle mikrošroubem, zaostření objektu naše oko nepostřehne. Postup je třeba trpělivě opakovat.
Imerzní mikroskopii lze provozovat pouze u mikroskopu, který je vybaven imerzním objektivem (označen jedním, častěji dvěmi černými proužky).
Upozorníme žáky na riziko zašpinění oděvu při práci s činidly, raději vyžadujeme použití pracovních plášťů nebo jiných ochranných oděvů.
Vedeme žáky k tomu aby po skončení práce důkladně omyli podložní a krycí sklíčka a důsledně z nich odstranili zbytky barviv a imerzního oleje. Většinou je nezbytné k dobrému odstranění barviv a zbytků oleje (ze skel, ale také např. ze stolků mikroskopů či pracovních stolů v laboratoři) použít např. ethanol.
Více informací o stopkovýtrusných houbách najdete např. v prezentaci Přírodovědecké fakulty JČU, galerii stopkovýtrusných hub nabízí např. Biolib – mezinárodní encyklopedie hub, rostlin a živočichů nebo Atlas houbových organizmů na stránkách PřF UP v Olomouci.
K pozorování se hodí výtrusy i řady dalších stopkovýtrusých hub, v naší úloze jsme vybírali zástupce s výtrusy barevně i tvarově různorodými.
Pro barvení Melzerovým činidlem se nejlépe hodí výtrusy právě holubinek a ryzců, jejichž ornamentika se zvýrazní reakcí škrobu na povrchu výtrusů s Melzerovým činidlem (pozn. Český mykolog Václav Melzer, podle nějž je činidlo pojmenováno, jej vyvinul právě pro pozorování ornamentiky výtrusů holubinek.) Ornamentika výtrusů je jedním z důležitých určovacích znaků holubinek.
Makromycetům se věnují také úlohy 108, 109, 111 a 112.

Obrazová dokumentace


Vlevo: Suchohřib hnědý (Xerocomus badius); Uprostřed: Muchomůrka růžovka (Amanita rubescens); Vpravo: Pečárka dvouvýtrusá (Agaricus bisporus) – Výtrusy. Vitální preparát ve vodě. Nahoře: Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + kamera CMOS 2; Dole: pozorováno v imerzi – Mikroskop LP 3012-T; objektiv 100/okulár 10 + kamera CMOS 2	1 – výtrus; 2 – tuková kapénka


Vlevo: Ryzec (Lactarius sp.); Uprostřed: Pestřec obecný (Scleroderma citrinum); Vpravo: Pýchavka obecná (Lycoperdon perlatum) – Výtrusy. Vitální preparát ve vodě. Nahoře: Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + kamera CMOS 2; Dole: pozorováno v imerzi – Mikroskop LP 3012-T; objektiv 100/okulár 10 + kamera CMOS 2; prostřední obrázek Nikon Coolpix L 20	1 – výtrus; 2 – ornamentika výtrusu


Vlevo: Holubinka (Russula sp.); Vpravo: Ryzec (Lactarius sp.) – Výtrusy se zvýrazněnou ornamentikou. Vitální preparát barvený Melzerovým činidlem; pozorováno v imerzi. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 100/okulár 10 + Nikon Coolpix L 20	1 – výtrus; 2 – ornamentika výtrusu