107. Kvasinky

Parametry úlohy

	Obtížnost:	lehké
	Časová náročnost:	50 minut
	Materiálová náročnost:	nenáročné
	Druh materiálu:	ostatní
	Čím pozorujeme:	mikroskop
	Téma:	Houby a lišejníky
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Kvasinky jsou organismy řazené do říše hub (Fungi), oddělení hub vřeckovýtrusých (Ascomycetes). Jedná se z velké části o jednobuněčné saprofytické organismy, vyskytující se v půdě, popř. v tělech živočichů (kvasinky rodu Candida mohou při svém přemnožení způsobovat nemoci kůže, sliznic nebo plic).

Rozmnožují se nepohlavně – pučením, při kterém mohou vznikat útvary označované jako pseudomycelia – nepravé podhoubí. Pokud ale dojde v okolním prostředí k úbytku živin a vody, mohou se kvasinky rozmnožovat i pohlavně. Zvětšené vegetativní buňky přebírají funkci vřecka, meioticky vzniknou čtyři haploidní výtrusy, fyziologicky rozlišené po dvojicích. Po prasknutí vřecka začnou uvolněné výtrusy v příznivých podmínkách klíčit v buňky a po splynutí dvou fyziologicky různých buněk vzniká diploidní zygota a z ní pučením nové buňky.

Někteří zástupci kvasinek mají velký hospodářský význam, zejména kvasinky schopné pomocí svých enzymů rozkládat cukry na ethanol a oxid uhličitý – např. kvasinka pivní se používá k výrobě piva, kvasinka vinná k výrobě vína. Lisované kvasinky pivní se prodávají jako pekařské droždí a umožňují kynutí těsta. Protože mají vysoký obsah vitamínů skupiny B, přidávají se do krmných směsí nebo slouží k výrobě léčiv.

Biotechnologicky využívané kvasinky musí vyhovovat normám, které stanovují kvalitu a vlastnosti kultury používané v dané biotechnologii. Normy stanovují např. povolené množství oslabených nebo mrtvých buněk v kultuře. Množství oslabených nebo mrtvých buněk můžeme stanovit jednoduchým vitálním testem.

Materiál

Kvasnice (pekařské droždí), cukr.

Pomůcky

Mikroskop, bakteriologické očko, pinzeta, Petriho misky, zkumavky, kádinky, kahan, zápalky, trojnožka, azbestová síťka, podložní a krycí sklíčka, preparační jehla, kapátko, voda, filtrační papír, 0,1 % roztok methylenové modři.

Úkoly

1. Pozorování kvasinek v nativním prepaprátu

Do kádinky rozdrobte kousek kvasnic, přidejte trochu cukru a vlažné vody (pozor – voda nesmí být horká, usmrtila by kvasinky). Promíchejte a nechte stát na teplém místě, dokud se na povrchu směsi nezačnou tvořit bubliny uníkajícího oxidu uhličitého. Bakteriologickým očkem přeneste kapku suspense kvasinek do kapky vody na podložním sklíčku a přikryjte krycím sklíčkem. Preparát pozorujte při středně velkém zvětšení. Vyhledejte místo, kde je preparát řidší a tvar a velikost buněk dobře patrné. Několik buněk zakreslete. Pokuste se v preparátu vyhledat pučící kvasinky, pokud se vám to povede, zakreslete je.

2. Provedení vitálního testu

Na podložní sklíčko kápněte kapku suspenze z kvasinek (použijte suspenzi z úkolu č.1), přikryjte krycím sklíčkem. K hraně krycího sklíčka přikápněte kapku methylenové modři a pomocí filtračního papíru, který přiložíte k opačné hraně krycího sklíčka, ji prosajte přes preparát. Obarvený preparát pozorujte pod mikroskopem. Spočítejte v 5 (10) zorných polích počet mrtvých buněk (sytě modré), počet živých buněk (bezbarvé; světle modré jsou buňky fyziologicky oslabené). Výsledek vyjádřete v %.

3. Provedení vitálního testu na kvasinkách prošlých varem

Odlijte část suspenze kvasinek do zkumavky, tu vložte do kádinky s vodou a krátce povařte nad kahanem. Na podložní sklíčko kápněte kapku převařené susupenze kvasinek, přikryjte krycím sklíčkem a preparát obarvěte methylénovou modří výše uvedeným způsobem. Zopakujte vitální test. Výsledky porovnejte. Jaký vliv má var na buňky kvasinek?

Výsledky pozorování

Na preparátu z úkolu č.1 zjistíme, že buňky kvasinek jsou široce oválné, některé pučí (příklad vegetativního rozmnožování).

Preparát druhé úlohy ukazuje kvasinky bezbarvé, světle modré a sytě modré. Je to proto, že plazmatická membrána živých buněk barvivo nepropouští, proto jsou tyto buňky bezbarvé. Plazmatická membrána mrtvývh buněk je nefunkční, tudíž zcela propustná, proto jsou buňky sytě modré. Pokud v prvním testu vyjde méně než 5 % mrtvých buněk, kvasnice vyhovují normám v pivovarnickém průmyslu (pivovarské kvasnice nesmí obsahovat více než 5 % mrtvých buněk).

Použijeme fotografií 4 výřezů ze zorných polí pro ukázku metodiky výpočtu vitálního testu:

Zorné pole	celkem buněk	živé buňky (bezbarvé)	mrtvé buňky (modré)	% mrtvých buněk
zorné pole A	220	171	49	22,3 %
Zorné pole B	485	477	8	1,6 %
Zorné pole C	886	881	5	0,6 %
Zorné pole D	194	152	42	21,6 %
Celkem	1785	1681	104	5,8 %

V každém řádku tabulky máme údaje z jednoho zorného pole. V dolním řádku pak údaje o počtech všech buněk, živých buněk i mrtvých buněk v součtu ze všech polí. Protože na první pohled se jedná o zorná pole s nestejnou hustotou vzorku (celkový počet pozorovaných buněk), použijeme pro výpočet % zastoupení živých a mrtvých buněk tyto sečtené údaje. 104 mrtvých buněk z celkového počtu 1785 buněk představuje 5,8 % populace, vzorek by tedy nevyhovoval normám pro použití v pivovaru.

Na preparátu z úkolu č.3 se ukazuje, že i po krátkém varu vitální test ukáže 100 % mrtvých buněk. Tedy i krátkodobý var buňky kvasinek hubí.

Metodické poznámky a doporučení

Vitální test je možné provádět u různě starých vzorků droždí a zjistit vliv stáří droždí na % mrtvých buněk či porovnávat kvalitu droždí od jednotlivých výrobců.
Vitální test je běžně používanou zkouškou v mikrobiologických laboratořích pivovarů.
Voda, kterou zaléváme kvasinky, nesmí být horká, kvasinky by zahubila.
Používané droždí by nemělo být napadené plísní, mohlo by to ovlivnit výsledky vitálního testu. Pokud tedy přinesou droždí žáci, je dobré jej předem zkontrolovat.
Fotografie 2, kterou jsme použili pro ukázku metodiky výpočtu vitálního testu, byla takto sestavena pro demonstraci toho, jak mohou různé vzorky vypadat – jak výrazně se mohou lišit. Fotografie je sestavena z přeparátů dvou různě starých vzorků (obr A, D představuje vzorek starých kvasnic, obrázek B, C pak vzorek kvasnic čerstvých) – což pro demonstraci metodiky nevadí. V souvislosti s různou hustotou vzorků můžeme žáky i upozornit na to, k jak rozdílným výsledkům se můžeme dopracovat, použijeme-li matematicky správný, nicméně z hlediska „selského rozumu“ nevhodný postup výpočtu. Kdybychom vypočítali % mrtvých buněk jako aritmetický průměr výsledků % ze 4 zorných polí, dostaneme se k číslu cca 11,5 % mrtvých buněk (tedy téměř dvojnásobek). Tento rozdíl ve výpočtu je způsobený tím, že obě zorná pole s vyšším % mrtvých buněk obsahovala výrazně méně buněk v celkovém počtu.
Pokud nám to školní vybavení umožňuje, je vhodnější pořídit fotografii zorného pole a počítat počty buněk po vytištění na papíře. Abychom žáky zcela nevyčerpali, je vhodné zadat různým žákům pozorujícím jeden vzorek spočítání jednoho zorného pole a z výsledků vytvořit společnou tabulku.

Obrazová dokumentace


Kvasinky (Sacharomyces cerevisiae) – Živé buňky kvasinek. Vitální preparát ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + kamera CMOS 2	1 – buňka kvasinky; 2 – pučící buňka


Kvasinky (Sacharomyces cerevisiae) – Buňky kvasinek – vitální test. Vitální preparát ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + kamera CMOS 2	A; D; C; D – jednotlivá zorná pole použitá v ukázce metodiky výpočtu vitálního testu; 1 – živá (bezbarvá) buňka; 2 – mrtvá (modrá) buňka


Kvasinky (Sacharomyces cerevisiae) – Buňky kvasinek – vitální test po varu. Vitální preparát ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + kamera CMOS 2	1 – mrtvá (modrá) buňka