106. Plísně VII. - fytoparazité

Parametry úlohy

	Obtížnost:	středně těžké
	Časová náročnost:	60 minut
	Materiálová náročnost:	náročné
	Druh materiálu:	volně rostoucí a kulturní rostliny
	Čím pozorujeme:	mikroskop
	Téma:	Houby a lišejníky
	Roční období:	září, říjen, listopad

Teoretický úvod

S postupem vegetační sezony se začínají na vegetativních i generativních orgánech řady rostlin objevovat typické projevy činnosti různých rostlinných parazitů – fytoparazitů. Orgány rostlin mohou měnit barvu, případně tvar, či na nich vyrůstají makroskopicky patrné orgány fytoparazitů. Pro tuto úlohu jsme vybrali 3 velmi hojné představitele a to hlízenku ovocnou a padlí ze skupiny vřeckovýtrusých hub – ascomycet (vřeckovýtrusým mikroskopickým zástupcům se věnují úlohy 102, 103, 104 a 105) a plíseň bramborovou ze skupiny řasovek – oomycet. Stejně jako u dalších plísní se při mikroskopování zaměřujeme na pozorování rozmnožovacích – fruktifikačních orgánů, jejichž vzhled a stavba bývají důležitými diagnostickýcmi znaky určitého rodu (druhu) plísně.

Hlízenka ovocná (Monilia fructigena) je konidiové stádium parazitické plísně způsobující tzv. moniliozu ovocných stromů. Charakteristickým projevem napadení ovocných plodů je hnědá nebo černá hniloba plodu se soustřednými kruhy světlých kupek konidií (nepohlavních výtrusů) na povrchu.
Jako padlí označujeme závazné parazity rostlin, kteří tvoří zpravidla na povrchu rosltinných orgánů přehrádkované mycelium. Do buněk pletiva hostitele pronikají zvláštními výrůstky mycelia zvanými haustoria. Vzhled jednotlivých zástupců (zbarvení a vzhled porostu) je u různých zástupců odlišný, stejně jako hostitel, na nějž se parazit specializuje. Patří sem řada druhů, pro naše pozorování jsme vybrali hojné a známé zástupce – padlí růžové (Sphaerotheca pannosa) a padlí dubové (Microsphaera alphitoides). U padlí lze dobře pozorovat jednak konidiové stádium – tvorbu specializovaných vláken – konidioforů, nesoucích nepohlavní výtrusy, zde nazývané oidie, ale také útvary pohlavního rozmnožování – uzavřené kulovité plodničky zvané kleistothecia, ze kterých se za zralosti uvolňují vřecka s pohlavně vzniklými výtrusy – askosporami. Kleistothecia různých druhů padlí mají charakteristické přívěsky – apendixy, podle kterých lze zástupce (rody, příp. druhy) poměrně dobře identifikovat.
Plíseň bramborová (Phytophthora infestans) patří mezi řasovky (oomycety), což jsou organismy s celulózní buněčnou stěnou, ve starších systémech řazené mezi houby. Právě složení buněčné stěny je jedním z důvodů nového řazení této skupiny do říše Chromista. Tato plíseň je jedním z nejvýznamějších fytoparazitů a působí značné hospodářské škody. Napadá lilkovité rostliny (brambory, rajčata) a nejdříve se projevuje na listech, na nichž vytváří žluté, později hnědé skvrny (na spodní straně listů se tvoří bílý povlak – vyrůstající sporangiofory), později zasahuje a ničí celou rostlinu. Na mikroskopickém preparátu jsou dobře pozorovatelnými útvary sporangiofory s jednosporovými sporangii tvaru citronu (na sporangiu je výrazná tzv. vyúsťovací papila – místo kudy sporangium klíčí). Ze sporangia (při dostatečné vlhkosti) může vyrůstat přímo houbové vlákno – hyfa, které se větví a nese další sporangiofory, nebo se sporangium otevírá a uvolňují se z něj dvoubičíkaté zoospory, z nichž teprve za vhodných podmínek klíčí nové hyfy.

Materiál

Ovocné plody s moniliózou, listy rajčat nebo brambor s projevy napadení plísní bramborovou, růže (části rostliny napadené padlím růžovým), dubové listy s projevy napadení padlím dubovým.

Pomůcky

Mikroskop, podložní a krycí sklíčko, 2 preparační jehly, žiletka nebo skalpel, pinzeta, kapátko, filtrační papír, voda, cottonová modř; Melzerovo činidlo, popř. také ethanol, laktofenol nebo fyziologický roztok, libovolný desinfekční prostředek (na úklid a utření stolů po práci).

Úkoly

1. Mikroskopické pozorování hlízenky ovocné v barveném preparátu

Pomocí preparační jehly seškrábněte jednu světlou kupku z ovoce napadeného moniliózou. V kapce vody nebo fyziologického roztoku jí pomocí preparačních jehel rozvolněte, přikápněte kapku cottonové modři a přikryjte krycím sklíčkem. Mírným tlakem bříškem palce na krycí sklíčko můžete preparát ještě „roztlačit“, aby vlákna plísně nebyla příliš hustě nahloučená. Pozorujte pod mikroskopem a zakreslete konidiofory s konidiemi.

2. Mikroskopické pozorování zástupců padlí v nativním a barveném preparátu

Pomocí preparační jehly seberte kousek pavučinovitého mycelia z povrchu poupěte (listu, stonku) růže. V kapce vody nebo fyziologického roztoku rozvolěte vlákna, přikápněte kapku cottonové modři nebo Melzerova činidla, přikryjte krycím sklíčkem a pozorujte. Zakreslete konidiofory s konidiemi. Z rubové strany dubových listů seškrábněte preparační jehlou několik drobných tmavých teček (jedná se o pouhým okem viditelná kleistothecia padlí). Umístěte je na podložní sklo do kapky vody, přikryjete krycím sklíčkem a pozorujte při menším zvětšení. Zakreslete klestothecium s vyrůstajími apendixy, zaměřte se na tvar a uspořádání koncových výběžků apendixů.

3. Mikroskopické pozorování plísně bramborové v nativním a barveném preparátu

Z rubové strany listů napadených plísní bramborovou sejměte preparační jehlou kousek bělavého mycelia, přeneste ho do kapky vody nebo fyziologického roztoku na podložním sklíčku, přikápněte kapku Melzerova činidla, přikryjte krycím sklíčkem a pozorujte. Zakreslete sporangiofory a sporangia.

Výsledky pozorování

Hlízenka ovocná vytváří konidie oválného až citronovitého tvaru. Konidie vyrůstají na konidioforech v dlouhých řetízcích, někdy mohou být řetízky větvené.

Konidie padlí růžového jsou oválné a nazýváme je oidie. Vznikají rozpadem specializovaných vláken konidioforů. Klesitothecia padlí dubového jsou zbarvena tmavě hnědě a jsou opatřena kolem dokola vyrůstajícími průhlednými dlouhými přívěsky – apendixy, které se na koncích bohatě větví (připomínají ledové či skleněné ornamenty).

V preparátu plísně bramborové pozorujeme rozvětvené sporangiofory a sporangia citronovitého tvaru. Každé sporangium obsahuje jednu spóru a má výraznou vyúsťovací papilu.

Metodické poznámky a doporučení

Zástupce, které jsme vybrali pro tuto úlohu, lze poměrně snadno identifikovat pouhým okem a také se jedná o značně rozšířené – tedy dostupné patogeny. Pod mikroskopem jsou také poměrně atraktivní (zejména kleistothecia padlí).
Hlízenku, padlí i píseň bramborovu lze pozorovat i v nativních preparátech, po obarvení se pozorované struktury pouze zvýrazní. My jsme použili barvené preparáty kvůli fotodokumentaci.
Při tvorbě mikroskopického preparátu je třeba manipulovat s plísní co nejopatrněji, sebrat s pomocí preparačních jehel opravdu pouze malý vzorek a dobře jej narovnat a rozprostřít. Častou chybou jsou příliš husté preparáty, na kterých kvůli částicím substrátu nebo nahloučeným částem mycelia není možné prosvítit jednotlivá vlákna mycelia a nalézt fruktifikační orgány.
Některé plísně jsou velmi těžko smáčitelné, takže je obtížné připravit preparát bez vzduchových bublin. V takových případech je možné připravit preparát do etanolu a ten postupně nahradit vodou (z jedné strany přidáváme vodu a z druhé odsáváme etanol filtračním papírem). Pro kreslení, identifikaci, popř. měření je vhodnější připravovat preparát v laktofenolu, pro běžné školní pozorování však stačí preparáty ve vodě nebo fyziologickém roztoku.
Při práci s plísněmi vedeme žáky k maximální opatrnosti, vzorky zplesnivělých potravin otvíráme jen na nezbytně nutnou dobu. Opatrnou manipulací s plísněmi bráníme šíření spór. Upozorníme žáky na nebezpečí plísní jako potencionálních patogenů a na jejich schopnost produkovat mykotoxiny. Po skončení práce si umyjeme ruce mýdlem a pracovní desky stolů otřeme např. zředěným roztokem SAVA, popř. jiným desinfekčním čisticím prostředkem.
Dalšími druhy plísní se zabývají úlohy 100, 101, 102, 103, 104 a 105.
V přírodě lze najít i mnohé další fytoparazitické druhy, kterým v naší databázi nevěnujeme pozornost. Pro rozšíření spektra vašich mikroskopických praktik nebo pro bližší určování fytoparazitických hub a příbuzných organismů (např. do druhů) může posloužit řada internetových zdrojů. Jedním z nich je tento atlas houbových organismů na stránkách PřF UP.

Obrazová dokumentace


Hlízenka ovocná (Monilia sp.) – Hyfy mycelia a konidie. Vitální preparát barvený cottonovou modří. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + kamera CMOS 2	1 – konidiofor; 2 – konidie

Vlevo: Padlí růžové (Sphaeroteca pannosa) – Konidiofory s oidiemi. Vitální preparát barvený cottonovou modří (nahoře) a Melzerovým činidlem (dole). Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + kamera CMOS 2 Vpravo: Padlí dubové (Microsphaera alphitoides) – Kleistothecia s charakteristickými apendixy. Vitální preparát ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 10; 20/okulár 10 + kamera CMOS 2

A; B – konidiofory s konidiemi; C – kleistothecia; D – detail kleistothecia s apendixy; 1 – konidiofor; 2 – oidie; 3 – klestothecium; 4 – apendix


Plíseň bramborová (Phytophthora infestans) – Sporangiofory a jednospórová sporangia. Vitální preparát barvený Melzerovým činidlem. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 20; 40/okulár 10 + kamera CMOS 2	A; B – sporangiofory s jednosporóvými sporangii; C – detail jednospórových sporangií; 1 – sporangiofor; 2 – sporangium; 3 – vyúsťovací papila