105. Plísně VI. - askomycety - další druhy plísní

Parametry úlohy

	Obtížnost:	středně těžké
	Časová náročnost:	60 minut
	Materiálová náročnost:	středně náročné
	Druh materiálu:	ostatní
	Čím pozorujeme:	mikroskop
	Téma:	Houby a lišejníky
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Většina plísní, se kterými se můžeme v běžném životě setkat, patří z hlediska systematického do skupiny hub vřeckovýtrusých (Ascomycetes), jejichž název je odvozen od útvaru vznikajícího při jejich pohlavním rozmnožování. Tento útvar se nazývá vřecko – askus a výtrusy, které v něm vznikají (zpravidla 8 výtrusů v každém vřecku), pak nazýváme askospory. Plísně, které mezi askomycety patří, se však pohlavně množí spíš ojediněle. V převážné většině případů potkáváme tyto houby v jejich nepohlavním stadiu, tj. ve stadiu tvorby nepohlavních výtrusů. Tyto nepohlavní výtrusy se obvykle nazývají konidie a vyrůstají na specializovaných hyfách – konidioforech. V mnoha případech se nepohlavní stádium od stádia pohlavně se množícího natolik odlišuje, že byla v minulosti tato dvě stádia popsána jako různé organismy. Proto také někdy můžeme najít nepohlavní stádia hub řazena do zvláštní skupiny tzv. nedokonalých hub (Deuteromycetes; Fungi imperfecti). V rámci této skupiny jsou pak houby tříděny zejména na základě podobnosti rozmnožovacích = fruktifikačních orgánů (tvar a větvení konidioforů, způsob vyrůstání, velikost a tvar konidií apod.).

Mezi další významné rody plísní patří Fusarium sp., Alternaria sp., Cladosporium sp. a Scopulariopsis sp., které můžeme velmi často najít na shnilých a zčernalých plodech. Srpovnička (Fusarium sp.) je původcem řady chorob rostlin. Způsobuje např. padání klíčních rostlin v množírnách, ucpává cévní svazky listů rostlin a způsobuje jejich vadnutí, žloutnutí a kroucení a je také velmi častou příčinou skladištní hniloby jablek, hrušek a jiných plodů. V mikroskopu je nezaměnitelným znakem tohoto rodu charakteristický tvar mnohobuněčných makrokonidií – srpečky (rohlíčky, půlměsíčky). Kromě těchto rohlíčkovitých makrokonidií vytváří plíseň ještě druhý typ – jedobuněční oválné mikrokonidie. Mnohé druhy rodu Fusarium produkují silné mykotoxiny.

Černání plodů způsobují nejčastěji zástupci, kteří se česky oznašují jako čerň. Jde o představitele rodů Alternaria a Cladosporium. Alternaria má rovněž nezaměnitelný tvar makrokonidií – jsou rozdělené podélně i příčně přepážkami a nazývají se muriformní konidie (připomínají složení cihel ve zdi; muris – lat. zeď). Cladosporium má konidie tvořené dvěma buňkami.

Plísně rodu Scopulariopsis patří rovněž k rozšířeným saprofytům, některé druhy jsou známé patogeny způsobující např. mykózy nehtů. Kulturní kmeny této plísně se spolu s kulturními kmeny rodu Penicillium aj. užívají k výrobě fermetnovaných trvanlivých salámu maďarského typu (např. uherák). Konidiofory plísně rodu Scopulariopsis jsou štětičkovité s kulatými konidiemi, stavbou pripomínají konidie štětičkovců.

Materiál

Plody ovoce napadené hnilobami hnědého nebo černého zbarvení,nebo hnijící ovoce s viditelným světlým plstnatým až vatovitým myceliem, případně kultivace plísní (např. na agarové plotně získané z mikrobiologické laboratoře) tmavě šedého a černého zbarvení, nebo vatovité povlaky světle bíle, žlutě, oranžově zbarvené. Slupka od uherského salámu s ušlechtilou plísní.

Pomůcky

Mikroskop, podložní a krycí sklíčko, 2 preparační jehly, žiletka nebo skalpel, pinzeta, kapátko, filtrační papír, voda, cottonová modř; popř. také ethanol, laktofenol nebo fyziologický roztok, libovolný desinfekční prostředek (na úklid a utření stolů po práci).

Úkoly

1. Mikroskopické pozorování srpovničky v nativním í barveném preparátu

Ze vzorku plísně, která způsobuje hnilobu ovocných plodů, nebo z porostu plísně vatovitého plstnatého vzhledu a světlé barvy, který narostl na jiném substrátu, připravte preparát v kapce vody nebo fyziologického roztoku. Pomocí preparačních jehel vzorek rozvolněte, aby nebyl příliš hustý. Přikryjte krycím sklíčkem, odsajte přebytečnou tekutinu a pozorujte. Zaměřte se na nález charakteristických konidií plísně rodu Fusarium. Zakreslete houbové vlákno a tvar a velikost konidií. Pro zvýraznění struktur povedený preparát obarvěte cottonovou modří (k jedné hraně krycího sklíčka přikápněte pár kapek barviva a filtračním papírem z druhé strany opatrně odsávejte přebytečnou tekutinu – zkontrolujte, že se celý preparát stejnoměrně probarvil, pokud ne, můžete velmi opatrně nadzvihnout růžek krycího sklíčka a znovu ho přiklopit), nechte barvivo cca 2 – 3 minuty působit a preparát znovu prohlédněte.

2. Mikroskopické pozorování černě

Ze vzorku plísně, která způsobuje čerň ovocných plodů, příp. zeleniny, nebo z porostu plísně tmavěšedého či černého zbarvení zhotovte mikroskopický preparát v kapce vody nebo fyziologického roztoku. Vzorek pomocí preparačních jehel dobře rozvolněte, aby nebyl příliš hustý. Pozorujte preparát pod mikroskopem a zakreslete houbová vlákna a konidie.

3. Mikroskopické pozorování plísně z uheráku v nativním i barveném preparátu

Pomocí preparační jehly sejměte kousek plísně ze slupky uherského salámu, vložte vzorek do vody nebo fyziologického roztoku, rozvolněte vlákna plísně a přikryjte krycím sklem. Filatračním papírem odsajte přebytečnou tekutinu a pozorujte pod mikroskopem. Zdařilý preparát dobarvěte cottonovou modří (postup viz úkol 1 barvení preparátu plsíně rodu Fusarium).

Výsledky pozorování

Při pozorování plísně rodu Fusarium najdeme v preparátu nezaměnitelný tvar konidií této plísně. Jednobuněčné oválné mikrokonidie bychom mohli snadno zaměnit s konidiemi jiných hub, ale vícebuněčné rohlíčkovité makrokonidie jsou jednoznačným identifkačním znakem této plísně. Po obarvení preparátu cottonovou modří a při větším zvětšení (cca 400×) lze zřetelně pozorovat rozdělení makrokonidií na jednotlivé buňky.

Při pozorování černých hnilob lze Velmi často v jednom preparátu najít více druhů plísní, zejména konidie obou zástupců, kteří černé hniloby způsobují – rodu Alternaria i rodu Cladosporium. Muriformní makrokonidie plísně Alternaria jsou výrazně větší než konidie ostatních druhů, rozdělené příčně i podélně přehrádkami, hnědě zbarvené a mají protáhlý tvar, na jednom konci se zpravidla zužují. Konidie plísně rodu Cladosporium jsou dvoubuněčné. Také mycelium obou zástupců bývá tmavě zbarvené, proto tyto preparáty není nutné dobarvovat. Vlákna mycelia jsou zpravidla zřetelně přehrádkovaná.

Ve vzorku z uheráku najdeme štětičkovité konidiofory připomínající tvarem rod štětičkovec. Na konidioforech jsou kulovité konidie.

Metodické poznámky a doporučení

Při pozorování vzorků získaných z hnijícího ovoce nebo zeleniny můžeme samozřejmě narazit i na řadu dalších zástupců plísní, tedy není zaručeno, že nalezneme právě jen zástupce zmiňované v této úloze. Díky stavbě konidií však zmiňované zástupce poměrně snadno identifikujeme.
Dalšími druhy plísní se zabývají úlohy 100, 101, 102, 103, 104 a 106.
Při výrobě fermentovaných salámů se kromě plísní rodu Scopulariopsis užívají i kulturní kmeny rodu Penicillium. Vzhledem k tomu, že obě plísně mají štětičkovité konidiofory, a pro „nemykology“ jsou tudíž obtížně rozeznatelné, upozorníme žáky, že to mohou být konidie obou rodů, protože oba rody se při výrobě užívají a výrobce zpravidla neinformuje o tom, jaký kmen plísně použil.
Při manipulaci s plísněmi vedeme žáky k maximální opatrnosti, vzorky zplesnivělých potravin otvíráme jen na nezbytně nutnou dobu. Opatrnou manipulací s plísněmi bráníme šíření spór. Upozorníme žáky na nebezpečí plísní jako potencionálních patogenů a na jejich schopnost produkovat mykotoxiny. Po skončení práce si umyjeme ruce mýdlem a pracovní desky stolů otřeme např. zředěným roztokem SAVA, popř. jiným desinfekčním čisticím prostředkem.
Při tvorbě mikroskopického preparátu je třeba manipulovat s plísní co nejopatrněji, sebrat s pomocí preparačních jehel opravdu pouze malý vzorek a dobře jej narovnat a rozprostřít. Častou chybou jsou příliš husté preparáty, na kterých kvůli částicím substrátu nebo nahloučeným částem mycelia není možné prosvítit jednotlivá vlákna mycelia a nalézt fruktifikační orgány.
Některé plísně jsou velmi těžko smáčitelné, takže je obtížné připravit preparát bez vzduchových bublin. V takových případech je možné připravit preparát do etanolu a ten postupně nahradit vodou (z jedné strany přidáváme vodu a z druhé odsáváme etanol filtračním papírem). Pro kreslení, identifikaci, popř. měření je vhodnější připravovat preparát v laktofenolu, pro běžné školní pozorování však stačí preparáty ve vodě nebo fyziologickém roztoku.
Pro bližší určování plísní (např. do druhů) může posloužit řada internetových zdrojů. Jedním z nich je tento Miniatlas mikroorganismů na stránkách VŠCHT, popř. Přehled zástupců vybraných mikroskopických askomycet na stránkách katedry botaniky PřF UK nebo také Atlas houbových organismů na stránkách PřF UP.
Plíseň ze sýru nebo jiného substrátu lze také naočkovat na agarovou plotnu (někdy se podaří sehnat pro výukové účely několik misek s agarovými půdami např. při exkurzi do mikrobiologické laboratoře, pak lze plíseň kultivovat.

Obrazová dokumentace


Čerň (Alternaria sp.) – Hyfy a mnohobuněčné (muriformní) konidie plísně. Vitální preparát ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 20, 40/okulár 10 + kamera CMOS 2	1 – přehrádkované hyfy; 2 – muriformní (příčně a podélně přehrádkované) makrokonidie


Srpovnička (Fusarium sp.) – Hyfy a rohlíčkovité makrokonidie plísně. Vlevo nahoře: Vitální preparát ve vodě; Vlevo dole a vpravo: Vitílní preparát barvený cottonovou modří. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + kamera CMOS 2	1 – hyfy; 2 – vícebuněčné rohlíčkovité makrokonidie; 3 – oválné jednobuněčné mikrokonidie

Vlevo: Čerň (Cladosporium sp.) – Dvoubuněčné konidie a hyfy plísně ve směsi konidií dalších druhů plísní. Vitální preparát ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + kamera CMOS 2 Vpravo: Plíseň na uheráku (Scopulariopsis sp.) – Hyfy mycelia konidie plísně. Vitální preparát barvený cottonovou modří. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + Nikon Coolpix L20

A; B; C; – dvoubuněčné konidie e směsi dalších konidií; D; E – hyfy a konidiofory s konidiemi; 1 – hyfa; 2 – dvoubuněčné konidie; 3 – kulovité konidie na konidioforu; 4 – konidiofor