104. Plísně V. - askomycety - štětičkovec (Penicillium)

Parametry úlohy

	Obtížnost:	středně těžké
	Časová náročnost:	40 minut
	Materiálová náročnost:	středně náročné
	Druh materiálu:	ostatní
	Čím pozorujeme:	mikroskop i stereomikroskop
	Téma:	Houby a lišejníky
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Většina plísní, se kterými se můžeme v běžném životě setkat, patří z hlediska systematického do skupiny hub vřeckovýtrusých (Ascomycetes), jejichž název je odvozen od útvaru vznikajícího při jejich pohlavním rozmnožování. Tento útvar se nazývá vřecko – askus a výtrusy, které v něm vznikají (zpravidla 8 výtrusů v každém vřecku), pak nazýváme askospory. Plísně, které mezi askomycety patří, se však pohlavně množí spíš ojediněle. V převážné většině případů potkáváme tyto houby v jejich nepohlavním stadiu, tj. ve stadiu tvorby nepohlavních výtrusů. Tyto nepohlavní výtrusy se obvykle nazývají konidie a vyrůstají na specializovaných hyfách – konidioforech. V mnoha případech se nepohlavní stádium od stádia pohlavně se množícího natolik odlišuje, že byla v minulosti tato dvě stádia popsána jako různé organismy. Proto také někdy můžeme najít nepohlavní stádia hub řazena do zvláštní skupiny tzv. nedokonalých hub (Deuteromycetes; Fungi imperfecti). V rámci této skupiny jsou pak houby tříděny zejména na základě podobnosti rozmnožovacích = fruktifikačních orgánů (tvar a větvení konidioforů, způsob vyrůstání, velikost a tvar konidií apod.).

Štětičkovec (Penicillium) patří k velmi rozšířeným rodům plísní a zahrnuje mnoho druhů. Rodové pojmenování je odvozeno podle štětičkovitého tvaru konidioforů této plísně. Porosty (kolonie) zástupců tohoto rodu jsou nejčastěji zpočátku bílé a od středu postupně tmavnou (to je způsobeno dozráváním konidií, které bývají zpravidla zelené, šedozelené či modrozelené barvy). Porosty těchto plísní mají sametový vzhled, jsou obvykle poměrně kompaktní a není lehké je oddělit od substrátu. V přírodě se jako saprofyté podílí na rozkladu, často také jako parazité napadají řadu rostlin a způsobují tzv. peniciliozy (velmi známé např. na citrusových plodech). Mnoho druhů produkuje významné mykotoxiny, známe však řadu kulturních kmenů této plísně, které jsou člověku prospěšné ať už k izolaci antibiotik (např. P. chrysogenum), nebo v biotechnologiích např. při výrobě sýrů (P. camembertii, P. roquefortii).

Materiál

Plísňové sýry (Hermelín, NIVA) nebo plesnivé potraviny (pečivo, ovoce) s plísněmi, které makroskopicky vykazují tyto znaky – nízké sametové porosty zelené, modrozelené či šedozelené barvy, často s bílým okrajem, pevně přirostlé k substrátu.

Pomůcky

Stereomikroskop nebo lupa, mikroskop, podložní a krycí sklíčko, Petriho miska, 2 preparační jehly, žiletka nebo skalpel, pinzeta, kapátko, filtrační papír, voda, cottonová modř; Melzerovo činidlo, popř. také ethanol, laktofenol nebo fyziologický roztok, libovolný desinfekční prostředek (na úklid a utření stolů po práci).

Úkoly

1. Pozorování štětičkovce pod binokulární lupou

Mezi vzorky zplesnivělých potravin vyberte takový, na kterém pouhým okem pozorujete sametovou plíseň zeleného nebo modrozeleného zbarvení s bílým okrajem, případně vezměte kousek plísňového sýra. Plíseň i s kouskem substrátu, na kterém vyrůstá, přeneste do Petriho misky, s plísní manipulujte opatrně, abyste co nejméně poničili křehkou strukturu vláken mycelia. Vzorek v misce uzavřete víčkem a pozorujte pod binokulární lupou. Zaměřte se zejména na prostorové uspořádání vláken mycelia a způsob, jakým na nich vyrůstají fruktifikační orgány – konidiofory s konidiemi. Poznamenejte si také barvu vláken mycelia a konidií.

2. Mikroskopické pozorování štětičkovce

Ze vzorku plísně, kterou jste pozorovali v úkolu č. 1, zhotovte preparát v kapce vody nebo fyziologického roztoku. Přikryjte krycím sklíčkem, odsajte přebytečnou tekutinu a pozorujte. Všímejte si stavby vláken mycelia (zda jsou či nejsou patrné přehrádky mezi buňkami), najděte konidiofor s konidiemi a pozorujte jejich stavbu. Zakreslete.

Klíčem k úspěchu je vytvoření dobrého preparátu. Na sklíčko přenášejte pomocí preparačních jehel opravdu velmi malý kousek plísně a dobře jej rozprostřete. Dejte pozor, abyste nabrali pouze vlákna plísně a ne kus substrátu.

3. Mikroskopické pozorování štětičkovce v preparátu barveném cottonovou modří a Melzerovým činidlem

V nativním preparátu není většinou možné pozorovat detailní stavbu konidiofórů a způsob vyrůstání konidií. Pro zvýraznění těchto morfologických znaků je třeba preparát obarvit.

Povedený nativní preparát (tj. takový, ve kterém zřetelně vidíte jak vlákna mycelia, tak konidiofory) obarvěte roztokem cottonové modři nebo Melzerova činidla (k jedné hraně krycího sklíčka přikápněte pár kapek barviva a filtračním papírem z druhé strany opatrně odsávejte přebytečnou tekutinu – zkontrolujte, že se celý preparát stejnoměrně probarvil, pokud ne, můžete velmi opatrně nadzvihnout růžek krycího sklíčka a znovu ho přiklopit) nechte barvivo cca 2 – 3 minuty působit a preparát znovu prohlédněte. Zakreslete stavbu konidiofóru a způsob vyrůstání konidií.

Výsledky pozorování

Pod binokulární lupou pozorujeme velmi drobné štětičkovité konidiofory vyrůstající z mycelia. Konidiofory a konidie bývají zelené (u některých druhů – např. u plísně získané z Hermelínu jsou bílé). Při malých zvětšeních stereomikroskopu nebývají konidiofory štětičkovce dobře viditelné, protože jsou obvykle velmi drobné. Na fotografii je zdokumentován útvar, který vypadá jako mnohonásobně zvětšený konidiofor štětičkovce. Jedná se o tzv. koremium (synnema) – pouhým okem viditelný shluk konidioforů – jeden z útvarů, který mohou někteří zástupci v nepohlavním stádiu vytvářet. Koremia mohou být větvená i nevětvená a jde o svazky vzpřímených konidioforů, které bývají ve spodní části spojené v jeden jakýsi „stonek“ a ve vrcholové části rozvolněné, takže z nich vyčnívají konce jednotlivých konidioforů.

V mikroskopickém preparátu pozorujeme přehrádkované hyfy a nesouměrně se větvící konidiofory (v preparátu je nutné proostřovat, abychom stavbu konidioforu zřetelně viděli). Na konidioforech lze popsat 3 typy buněk – podlouhlé podpůrné buňky tzv. metuly, na nich vyrůstající konidiotvorné buňky – fialidy rovněž podlouhlého (lahvicovitého) tvaru a vlastní kulovité konidie, které vznikají odškrcováním fialid.

Metodické poznámky a doporučení

Ačkoliv štětičkovec patří k modelovým organismům, které jsou uváděny v každé učebnici, nepatří z hlediska atraktivity pozorování k nejlepším zástupcům. Ze zkušenosti můžeme říci, že se dětem málokdy podaří vytvořit preparát, kde jsou zřetelně vidět fruktifikační orgány. Začátečníkům v oblasti mikroskopie lze spíš doporučit pozorováný zygomycet – plísně hlavičkové či kropidlovce (Mucor sp., Rhizopus sp.) nebo plísně šedé (Botrytis cinerea) – viz úlohy 100, 101 a 103 v naší databázi. Dalšími druhy plísní se zabývají ještě úlohy 102, 105 a 106.
Plísně rodu štětičkovec jsou časté na citrusových plodech, které však nedporučujeme užívat jako materiál pro odběr plísně. Plíseň má poměrně kompaktní mycelium, které při nárůstu na tvrdé slupce citrusů není možné dobře odebrat. Preparáty odebírané z citrusů bývají plné vysypaných konidií a zpravidla není možné v nich najít vlákno mycelia či celý konidiofor s konidiemi.
I když jsou preparáty štětičkovců povedené, nebývají hyfy a konidiofory příliš výrazné. Pro lepší pozorování doporučujeme preparáty obarvit (viz úkol č.3).
Při manipulaci s plísněmi vedeme žáky k maximální opatrnosti, vzorky zplesnivělých potravin otvíráme jen na nezbytně nutnou dobu, pod binokulární lupou pozorujeme vzorky uzavřené v Petriho misce. Opatrnou manipulací s plísněmi bráníme šíření spór. Upozorníme žáky na nebezpečí plísní jako potencionálních patogenů. Po skončení práce si umyjeme ruce mýdlem a pracovní desky stolů otřeme např. zředěným roztokem SAVA, popř. jiným desinfekčním čisticím prostředkem.
Při tvorbě mikroskopického preparátu je třeba manipulovat s plísní co nejopatrněji, sebrat s pomocí preparačních jehel opravdu pouze mycelium plísně (bez částí substrátu) a pomocí preparačních jehel vzorek dobře narovnat a rozprostřít. Častou chybou jsou příliš husté preparáty, na kterých kvůli částicím substrátu nebo nahloučeným částem mycelia není možné prosvítit jednotlivá vlákna mycelia nebo pak preparáty, kde jsou pouze vysypané konidie a chybí konidiofory či jiné hyfy.
Štětičkovce patří ke druhům, které jsou velmi těžko smáčitelné, takže je obtížné připravit preparát bez vzduchových bublin. V takových případech je možné připravit preparát do etanolu a ten postupně nahradit vodou (z jedné strany přidáváme vodu a z druhé odsáváme etanol filtračním papírem). Pro kreslení, identifikaci, popř. měření je vhodnější připravovat preparát v laktofenolu, pro běžné školní pozorování však stačí preparáty ve vodě nebo fyziologickém roztoku.
Pro bližší určování plísní (např. do druhů) může posloužit řada internetových zdrojů. Jedním z nich je tento Miniatlas mikroorganismů na stránkách VŠCHT, popř. Přehled zástupců vybraných mikroskopických askomycet na stránkách katedry botaniky PřF UK nebo také Atlas houbových organismů na stránkách PřF UP.
Plíseň ze sýru nebo jiného substrátu lze také naočkovat na agarovou plotnu (někdy se podaří sehnat pro výukové účely několik misek s agarovými půdami, např. při exkurzi do mikrobiologické laboratoře, pak lze plíseň kultivovat a pozorovat).

Obrazová dokumentace


Vlevo: Štětičkovec (Penicillium sp.) – Zvláštní uspořádání konidioforů tzv. koremium ; Vpravo: porost plísně – mycelium s konidiofory. Stereomikroskop model SZS 1002-T ZOOM; objektiv – zoom 2,5; 4/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	A – koremium (svazek konidioforů); B – celkový pohled na porost plísně; 1 – hyfy mycelia; 2 – koremium; 3 – konidiofory; 4 – svazek konidioforů na vrcholku koremia


Štětičkovec (Penicillium sp.) – Konidiofory s konidiemi. Vlevo: Vitální preparát ve vodě. Vpravo: Vitální preparát barvený cottonovou modří. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 20, 40/okulár 10 + kamera CMOS 2 a Nikon Coolpix L20	A; B; D – celkový pohled na mycelium a konidiofory s konidiemi; C – detail stavby konidioforu; 1 – konidiofor, 2 – větve konidioforu; 3 – metuly; 4 – fialidy; 5 – konidie, 6 – hyfy mycelia


Štětičkovec (Penicillium sp.) – Konidiofory s konidiemi. Vitální preparát barvený Melzerovým činidlem. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 20,/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – konidiofor; 2 – přehrádka mezi buňkami ve vláknu konidioforu; 3 – konidie