103. Plísně IV. - askomycety - plíseň šedá (Botrytis)

Parametry úlohy

	Obtížnost:	lehké
	Časová náročnost:	20 minut
	Materiálová náročnost:	středně náročné
	Druh materiálu:	ostatní
	Čím pozorujeme:	mikroskop i stereomikroskop
	Téma:	Houby a lišejníky
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Většina plísní, se kterými se můžeme v běžném životě setkat, patří z hlediska systematického do skupiny hub vřeckovýtrusých (Ascomycetes), jejichž název je odvozen od útvaru vznikajícího při jejich pohlavním rozmnožování. Tento útvar se nazývá vřecko – askus a výtrusy, které v něm vznikají (zpravidla 8 výtrusů v každém vřecku), pak nazýváme askospory. Plísně, které mezi askomycety patří, se však pohlavně množí spíš ojediněle. V převážné většině případů potkáváme tyto houby v jejich nepohlavním stadiu, tj. ve stadiu tvorby nepohlavních výtrusů. Tyto nepohlavní výtrusy se obvykle nazývají konidie a vyrůstají na specializovaných hyfách – konidioforech. V mnoha případech se nepohlavní stádium od stádia pohlavně se množícího natolik odlišuje, že byla v minulosti tato dvě stádia popsána jako různé organismy. Proto také někdy můžeme najít nepohlavní stádia hub řazena do zvláštní skupiny tzv. nedokonalých hub (Deuteromycetes; Fungi imperfecti). V rámci této skupiny jsou pak houby tříděny zejména na základě podobnosti rozmnožovacích = fruktifikačních orgánů (tvar a větvení konidioforů, způsob vyrůstání, velikost a tvar konidií apod.).

Plíseň šedá (Botrytis sp.) vyrůstá v podobě šedého vzdušného mycelia na plodech různých druhů ovoce a zeleniny – při delším nebo nevhodném skladování (zcela spolehlivě se objeví po pár dnech skladování např. na jahodách, ale i na rajčatech, hroznovém vínu, příp. mrkvi) – napadený plod má potom doslova „chlupatý vzhled“. Rod Botrytis je významným rostlinným patogenem. Druh Botrytis cinerea se také někdy nazývá ušlechtilá plíseň vinných hroznů a bobule touto plísní napadené se užívají k výrobě tokajského vína.

Materiál

Plesnivé ovoce (nejlépe jahody, případně rajčata) s plísní, která se makroskopicky jeví jako bělavě šedý až šedý chlupatý porost, při podrobnějším pohledu lze vidět na myceliu drobné hrozníčky bělavých konidií (viz foto 1 v této úloze).

Pomůcky

Stereomikroskop nebo lupa, mikroskop, podložní a krycí sklíčko, Petriho miska, 2 preparační jehly, žiletka nebo skalpel, pinzeta, kapátko, krycí sklíčko, podložní sklíčko, filtrační papír, fyziologický roztok, libovolný desinfekční prostředek (na úklid a utření stolů po práci).

Úkoly

1. Pozorování plísně šedé pod binokulární lupou

Mezi vzorky zplesnivělých potravin vyberte takový, na kterém pouhým okem pozorujete bělavě šedou až šedou chlupatou plíseň. Tuto plíseň i s kouskem substrátu, na kterém vyrůstá, přeneste do Petriho misky, s plísní manipulujte opatrně, abyste co nejméně poničili křehkou strukturu vláken mycelia. Vzorek v misce uzavřete víčkem a pozorujte pod binokulární lupou. Zaměřte se zejména na prostorové uspořádání vláken mycelia a způsob, jakým na nich vyrůstají fruktifikační orgány – konidiofory s konidiemi. Poznamenejte si také barvu vláken mycelia a konidií.

2. Mikroskopické pozorování plísně šedé

Ze vzorku plísně, kterou jste pozorovali v úkolu č. 1, zhotovte preparát v kapce vody nebo fyziologického roztoku. Přikryjte krycím sklíčkem, odsajte přebytečnou tekutinu a pozorujte. Všímejte si stavby vláken mycelia (zda jsou či nejsou patrné přehrádky mezi buňkami), najděte konidiofor s konidiemi a pozorujte jejich stavbu. Zakreslete. Klíčem k úspěchu je vytvoření dobrého preparátu. Na sklíčko přenášejte pomocí preparačních jehel opravdu velmi malý kousek plísně a dobře jej rozprostřete. Dejte pozor, abyste nabrali pouze vlákna plísně a ne kus substrátu.

Výsledky pozorování

Pod binokulární lupou pozorujeme, že plíseň šedá vytváří prostorově uspořádanou vzdušnou spleť obvykle šedých hyf, na kterých hustě vyrůstají konidiofory s konidiemi upořádanými do drobných hroznů (podobné „hroznovému vínu“). Konidie mají bílé zbarvení. V mikroskopu můžeme pozorovat tmavě zbarvené přehrádkované hyfy. Rovněž konidiofory jsou přehrádkované a na konci se stromečkovitě větví a nesou konidie uspořádané do drobných hroznů. Konidie vyrůstají z rozšířené části konidioforu, která se nazývá měchýřek. Konidie jsou oblé, kulovité nebo protáhlé a vždy jednobuněčné.

Metodické poznámky a doporučení

Plíseň šedá je jedním z nejvhodnějších zástupců pro pozorování plísní. Lze jí snadno vypěstovat (zejména v odbobí plodu jahod ji spolehlivě vypěstujeme během několika dní) a v porovnání s jinými druhy plísní je u ní výrazně jednodušší vytvořit pěkný preparát (a to i bez použití ethanolu či laktofelnolu, které doporučujeme pro tvorbu preparátů některých jiných plísní).
Plíseň šedá má hyfy i konidiofory s konidiemi v preparátu tmavě zbarvené a lze ji velmi dobře pozorovat. Preparáty není nutné barvit, jak doporučujeme u jiných druhů plísní.
Při manipulaci s plísněmi vedeme žáky k maximální opatrnosti, vzorky zplesnivělých potravin otvíráme jen na nezbytně nutnou dobu, pod binokulární lupou pozorujeme vzorky uzavřené v Petriho misce. Opatrnou manipulací s plísněmi bráníme šíření spór. Upozorníme žáky na nebezpečí plísní jako potencionálních patogenů. Po skončení práce si umyjeme ruce mýdlem a pracovní desky stolů otřeme např. zředěným roztokem SAVA, popř. jiným desinfekčním čisticím prostředkem.
Při tvorbě mikroskopického preparátu je třeba manipulovat s plísní co nejopatrněji, sebrat pomocí preparačních jehel opravdu pouze mycelium plísně (bez částí substrátu) a pomocí preparačních jehel vzorek dobře narovnat a rozprostřít. Častou chybou jsou příliš husté preparáty, na kterých kvůli částicímu substrátu nebo nahloučeným částem mycelia není možné prosvítit jednotlivá vlákna mycelia nebo pak preparáty, kde jsou pouze kousky hyf a vysypané spory (poškození v souvislosti s hrubou manipulací s křehkým objektem).
Plíseň šedá (Botrytis sp.) je svým vzhledem charakteristická a lze ji poměrně snadno určit, jak na základě makroskopického vzhledu, tak v mikroskopickém preparátu.
Dalšími druhy plísní se zabývají také úlohy 100, 101, 102, 104, 105 a 106.
Pro bližší určování plísní může posloužit řada internetových zdrojů. Jedním z nich je tento Miniatlas mikroorganismů na stránkách VŠCHT nebo přehled zástupců vybraných mikroskopických askomycet na stránkách katedry botaniky PřF UK.

Obrazová dokumentace


Plíseň šedá (Botrytis sp.) – Mycelium plísně s konidiemi. Stereomikroskop model SZS 1002-T ZOOM; objektiv – zoom 0,7; 4/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	A – mycelium s konidiofory a konidiemi; B – nárůst plísně na jahodě; 1 – hyfa; 2 – konidiofor s hroznem konidií


Plíseň šedá (Botrytis sp.) – Konidiofory s konidiemi. Vitální preparát ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 20/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	A – celkový pohled na konidiofory s konidiemi; B – detail rozvětveného konce konidioforu; 1 – přehrádkované vlákno; 2 – rozvětvený konidiofor s hroznem konidií; 3 – konidie; 4 – měchýřek


Plíseň šedá (Botrytis sp.) – Detail konidioforu a konidií. Vitální preparát ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 40/okulár 10 + kamera CMOS 2	A – detail konidií; B – detail rozvětveného konidioforu; 1 – přehrádkované vlákno; 2 – konidie; 3 – měchýřek