101. Plísně II. - zygomycety - kropidlovec (Rhizopus)

Parametry úlohy

	Obtížnost:	středně těžké
	Časová náročnost:	30 minut
	Materiálová náročnost:	středně náročné
	Druh materiálu:	ostatní
	Čím pozorujeme:	mikroskop i stereomikroskop
	Téma:	Houby a lišejníky
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Mezi běžně se vyskytujícími saprofytickými plísněmi, se kterými se často setkáváme např. při špatném uskladnění či dlouhém skladování potravin, většinou rozeznáme zygomycety podle světlého vzdušného mycelia a mnohdy pouhým okem viditelných tmavých sporangií. Nejznámější rody ze skupiny zygomycet – plíseň (Mucor) a kropidlovec (Rhizopus) rozeznáme až při pozorování pod mikroskopem (někdy postačí stereomikroskop).

Nepohlavně se tyto plísně rozmnožují většinou nepohlavními výtrusy – sporangiosporami, které se tvoří v uzavřených výtrusnicích – sporangiích. Sporangia se tvoří na koncích speciálních nosičů – sporangioforů. Rozšířený konec sporangioforu, který je uvnitř sporangia, se nazývá sterilní sloupek – kolumela. Tento sloupek bývá viditelný pod mikroskopem, pokud dojde k porušení sporangií a vysypání sporangiospor (k takovému porušení dochází běžně téměř v každém preparátu).

Pohlavní rozmnožování těchto hub se nazývá spájení. Sousední vlákna vytvoří kopulační výběžky, kterými se spojí, a vznikne tlustostěnná zygospora. Z té později vyrůstá také sporangium, nesoucí spory vzniklé pohlavním procesem. Nazývá se klíční sporangium.

Rod kropidlovec (Rhizopus) je v přírodě poměrně hojným rodem. Jeho sporangia vyrůstají ve svazečcích na specializovaných hyfách, kterým říkáme stolony. Tyto hyfy slouží k rychlému šíření plísně po substrátu, k němuž se přichycují pomocí zvláštních kořínkovitých útvarů – rhizoidů. Patří mězi běžné rozkladače organického materiálu. Díky svým fermentačním schopnostem (zkvašuje cukry na alkohol) se některé druhy využívají v biotechnologiích.

Kromě znehodnocování potravin, které patří mezi důležité negativní vlivy těchto plísní, způsobuje u řady lidí alergie. Proto je nezbytné vždy při práci s plísněmi dbát maximální opatrnosti. Některé druhy rodu kropidlovec mohou produkovat houbové jedy – mykotoxiny.

Materiál

Plesnivé potraviny (pečivo, ořechy, ovoce) s plísněmi, které makroskopicky vykazují tyto znaky – světlé (bílé až šedé) vzdušné mycelium, později s rozeznatelnými kulovitými výtrusnicemi, které jsou zpočátku světlé a se stářím tmavnou. Při pozorném pohledu pouhým okem nebo obyčejnou lupou rozeznáme kropidlovec (Rhizopus) podle toho, že sporangiofóry nesoucí sporangia vyrůstají z mycelia ve skupinách – svazečcích.

Pomůcky

Stereomikroskop nebo lupa, mikroskop, podložní a krycí sklíčko, Petriho miska, 2 preparační jehly, žiletka nebo skalpel, pinzeta, kapátko, filtrační papír, popř. také ethanol, laktofenol nebo fyziologický roztok, libovolný desinfekční prostředek (na úklid a utření stolů po práci).

Úkoly

1. Pozorování plísně pod binokulární lupou

Mezi vzorky zplesnivělých potravin vyberte takový, na kterém pouhým okem pozorujete bělavou vzdušnou plíseň pavučinovitého vzhledu, jejíž sporangiofory vyrůstají ve svazečcích. Tuto plíseň i s kouskem substrátu, na kterém vyrůstá, přeneste do Petriho misky. S plísní manipulujte opatrně, abyste co nejméně poničili křehkou strukturu vláken mycelia. Vzorek v misce uzavřete víčkem a pozorujte. Zaměřte se zejména na prostorové uspořádání vláken mycelia a způsob, jakým na nich vyrůstají sporangia. Poznamenejte si také barvu vláken mycelia a sporangií.

2. Mikroskopické pozorování plísně rodu Rhizopus

Ze vzorku plísně, kterou jste pozorovali v úkolu č. 1., zhotovte preparát v kapce vody nebo fyziologického roztoku. Přikryjte krycím sklíčkem, odsajte přebytečnou tekutinu a pozorujte. Všímejte si stavby vláken mycelia (zda jsou či nejsou patrné přehrádky mezi buňkami), pozorujte, jakým způsobem vyrůstají sporangiofory ze specializovaných hyf – tzv. stolonů. Dále si všímejte stavby sporangia (pokuste se najít nepoškozené sporangium). Všimněte si útvarů, které vyrůstají z mycelia v místě odstupu sporangioforů – tyto útvary pro jejich vzhled připomínající kořeny nazýváme rhizoidy. Pozorujte sporangiospory (tvar a velikost), které se vysypaly při manipulaci se vzorkem z poškozených sporangií. Zakreslete stolon, sporangiofory, rhizoidy, sporangium a sporangiospory, případně kolumelu.

Pozn. Klíčem k úspěchu je vytvoření dobrého preparátu. Na sklíčko přenášejte pomocí preparačních jehel opravdu velmi malý kousek plísně a dobře jej rozprostřete. Dejte pozor, abyste nabrali pouze vlákna plísně a ne kus substrátu.

Výsledky pozorování

Sporangiofory rodu kropidlovec jsou jednoduché, vyrůstají ve svazcích po několika, ze zvláštních hyf – stolonů a ze stejného místa, odkud vyrůstají také rhizoidy. Blána u zralých sporangií se trhá, ale nemizí jako u rodu Mucor. Kolumely mají většinou čočkovitý nebo polokulovitý tvar, často také splasknou a překlopí se, takže vypadají jako deštník. Sporangiospóry nejsou tak oblé jako u rodu Mucor a mají mnohem varabilnější tvar.

Metodické poznámky a doporučení

Substrát pro pěstování plísní je třeba připravit v dostatečném předstihu (zhruba týden před konáním praktického cvičení). Nejčastěji naroste tento rod plísně na pečivu či přezrálých plodech ovoce. Ideálními podmínkami pro růst plísní jsou vlhko, pokojová teplota a přístup vzduchu.
Při manipulaci s plísněmi vedeme žáky k maximální opatrnosti, vzorky zplesnivělých potravin otvíráme jen na nezbytně nutnou dobu, pod binokulární lupou pozorujeme vzorky uzavřené v Petriho misce. Opatrnou manipulací s plísněmi bráníme šíření spór. Upozorníme žáky na nebezpečí plísní jako potencionálních patogenů. Po skončení práce si umyjeme ruce mýdlem a pracovní desky stolů otřeme např. zředěným roztokem SAVA, popř. jiným desinfekčním čisticím prostředkem. Místnost ve které jsme prováděli praktika, dobře vyvětráme!
Zralé výtrusnice kropidlovce jsou velmi křehké a obvykle bývá obtížné připravit mikroskopický preparát s neporušenými sporangii této plísně.
Některé druhy plísní jsou velmi těžko smáčitelné, takže je obtížné připravit preparát bez vzduchových bublin. V takových případech je možné připravit preparát do ethanolu a ten postupně nahradit vodou (z jedné strany přidáváme vodu a z druhé odsáváme ethanol filtračním papírem). Pro kreslení, identifikaci, popř. měření je vhodnější připravovat preparát v laktofenolu, pro běžné školní pozorování však stačí preparáty ve vodě nebo fyziologickém roztoku.
Při tvorbě mikroskopického preparátu je třeba manipulovat s plísní co nejopatrněji, sebrat pomocí preparačních jehel opravdu pouze mycelium plísně (bez částí substrátu) a pomocí preparačních jehel vzorek dobře narovnat a rozprostřít. Častou chybou jsou příliš husté preparáty, na kterých kvůli částicím substrátu nebo nahloučeným částem mycelia není možné prosvítit jednotlivá vlákna mycelia, nebo pak preparáty, kde jsou pouze popraskaná sporangia a vysypané spory (poškození v souvislosti s hrubou manipulací s křehkým objektem).
Kropidlovec (Rhizopus sp.), stejně jako plíseň hlavičková (Mucor sp.) patří k nejznámějším rodům ze skupiny spájivých hub. Pokud připravený preparát má jiné než popisované znaky, může se jednat o další zástupce spájivých hub. Dalšími rody jsou pak např. rod Absidia sp. – obloukovka, Rhizomucor sp. apod. Určovacími znaky jsou například přítomnost a tvar kolumely, tvar a větvení sporangioforů, přítomnost rhizoidů, velikost a tvar spor apod.
Dalšími druhy plísní se zabývají také úlohy 100, 102, 103, 104, 105 a 106.
Pro bližší určování plísné může posloužit řada internetových zdrojů. Jedním z nich je tento Miniatlas mikroorganismů na stránkách VŠCHT nebo přehled zástupců zygomycet na stránkách katedry botaniky PřF UK.

Obrazová dokumentace


Kropidlovec (Rhizopus sp.) – Mycelium plísně se sporangii a rhizoidy. Stereomikroskop model SZS 1002-T ZOOM; objektiv – zoom 3 – 4/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	A – pohled na svazek sporangioforů se sporangii; B – detail sporangia na sporangioforu; 1 – sporangiofor; 2 – sporangium; 3 – rhizoidy; 4 – hyfy mycelia


Kropidlovec (Rhizopus sp.) – Svazek sporangioforů s rhizoidy. Vitální preparát vlevo na sucho, vpravo ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 10/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	1 – sporangiofor; 2 – sporangium; 3 – rhizoidy

Kropidlovec (Rhizopus sp.) – Svazek sporangioforů; detaily sporangií, kolumel a sporangiospór. Vitální preparát ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 4, 10, 20/okulár 10 + Nikon Coolpix L20

A – svazek sporangioforů; B – detail rhizoidů; C – detail sporangioforů s kolumelami; D – detail otevřených sporangií; E – sporangiospory; 1 – sporangiofor; 2 – sporangium; 3 – sporangiospory; 4 – kolumela (rozšířené zakončení sporangioforu, které je uvnitř sporangia a je viditelné až po uvolnění výtrusů při zralosti sporangia); 5 – rhizoidy; 6 – stolon (specializovaná hyfa, na níž vyrůstají svazky sporangioforů a rhizoidy)