100. Plísně I. - zygomycety - plíseň hlavičková (Mucor)

Parametry úlohy

	Obtížnost:	středně těžké
	Časová náročnost:	30 minut
	Materiálová náročnost:	středně náročné
	Druh materiálu:	ostatní
	Čím pozorujeme:	mikroskop i stereomikroskop
	Téma:	Houby a lišejníky
	Roční období:	září, říjen, listopad, prosinec, leden, únor, březen, duben, květen, červen

Teoretický úvod

Mezi běžně se vyskytujícími saprofytickými plísněmi, se kterými se často setkáváme např. při špatném uskladnění či dlouhém skladování potravin, většinou rozeznáme zygomycety podle světlého vzdušného mycelia a mnohdy pouhým okem viditelných tmavých sporangií. Nejznámější rody ze skupiny zygomycet – plíseň (Mucor) a kropidlovec (Rhizopus) rozeznáme až při pozorování pod mikroskopem (někdy postačí stereomikroskop).

Nepohlavně se tyto plísně rozmnožují většinou nepohlavními výtrusy – sporangiosporami, které se tvoří v uzavřených výtrusnicích – sporangiích. Sporangia se tvoří na koncích speciálních nosičů – sporangioforů. Rozšířený konec sporangioforu, který je uvnitř sporangia, se nazývá sterilní sloupek – kolumela. Tento sloupek bývá viditelný pod mikroskopem, pokud dojde k porušení sporangií a vysypání sporangiospor (k takovému porušení dochází běžně téměř v každém preparátu).

Pohlavní rozmnožování těchto hub se nazývá spájení. Sousední vlákna vytvoří kopulační výběžky, kterými se spojí a vznikne tlustostěnná zygospora. Z té později vyrůstá také sporangium, nesoucí spory vzniklé pohlavním procesem. Nazývá se klíční sporangium.

Rod Mucor je v přírodě značně rozšířený, patří mezi běžné rozkladače organického materiálu. Kromě znehodnocování potravin, které patří mezi důležité negativní vlivy těchto plísní, způsobuje u řady lidí alergie. Proto je nezbytné vždy při práci s plísněmi dbát maximální opatrnosti.

Materiál

Plesnivé potraviny (pečivo, ořechy, ovoce) s plísněmi, které makroskopicky vykazují tyto znaky – světlé (bílé až šedé) vzdušné mycelium, později s rozeznatelnými kulovitými výtrusnicemi, které jsou zpočátku světl a se stářím tmavnou. Pokud při pozorném pohledu pouhým okem nebo obyčejnou lupou vidíme, že sporangiofóry nesoucí sporangia vyrůstají z mycelia jednotlivě, pak se pravděpodobně jedná o rod plíseň rodu Mucor.

Pomůcky

Stereomikroskop nebo lupa, mikroskop, podložní a krycí sklíčko, Petriho miska, 2 preparační jehly, žiletka nebo skalpel, pinzeta, kapátko, filtrační papír, popř. také ethanol, laktofenol nebo fyziologický roztok, libovolný desinfekční prostředek (na úklid a utření stolů po práci).

Úkoly

1. Pozorování plísně pod binokulární lupou

Mezi vzorky zplesnivělých potravin vyberte takový, na kterém pouhým okem pozorujete bělavou vzdušnou plíseň pavučinovitého vzhledu. Tuto plíseň i s kouskem substrátu, na kterém vyrůstá, přeneste do Petriho misky, s plísní manipulujte opatrně, abyste co nejméně poničili křehkou strukturu vláken mycelia. Vzorek v misce uzavřete víčkem a pozorujte. Zaměřte se zejména na prostorové uspořádání vláken mycelia a způsob, jakým na nich vyrůstají sporangia. Poznamenejte si také barvu vláken mycelia a sporangií.

2. Mikroskopické pozorování plísně rodu Mucor

Ze vzorku plísně, kterou jste pozorovali v úkolu č. 1., zhotovte preparát v kapce vody nebo fyziologického roztoku. Přikryjte krycím sklíčkem, odsajte přebytečnou tekutinu a pozorujte. Všímejte si stavby vláken mycelia (zda jsou či nejsou patrné přehrádky mezi buňkami), pozorujte stavbu sporangioforu a sporangia (pokuste se najít nepoškozené sporangium). Pozorujte sporangiospory (tvar a velikost), které se vysypaly při manipulaci se vzorkem z poškozených sporangií. Zakreslete vlákno, sporangiofor, sporangium a sporangiospory, kolumelu.

Pozn. Klíčem k úspěchu je vytvoření dobrého preparátu. Na sklíčko přenášejte pomocí preparačních jehel opravdu velmi malý kousek plísně a dobře jej rozprostřete. Dejte pozor, abyste nabrali pouze vlákna plísně a ne kus substrátu.

Výsledky pozorování

Pod stereomikroskopem jsou zřetelně vidět kulovitá sporangia plísně, která jsou nejprve bílá, starší pak postupně tmavší od hnědavě šedých až do tmavě hnědé. Pod mikroskopem, nejlépe při zvětšení 200× – 400× pozorujeme, že vlákna jsou bez přehrádek. Sporangia jsou kulovitého tvaru. Sporangiofory u rodu Mucor jsou jednoduché nebo větvené, u zralých sporangií mizí blána na povrchu sporangia a zůstává pouze tzv. „límec“ kolem kolumely. Kolumely jsou různého tvaru. Spóry většinou oblé, elipsoidní až kulovité.

Metodické poznámky a doporučení

Substrát pro pěstování plísní je třeba připravit v dostatečném předstihu (min. týden před konáním praktického cvičení). Obvykle stačí dát do uzavíratelné krabičky část navlhčeného krajíce chleba, nechat přes noc otevřenou krabičku v chlebovce a ráno pak vyndat, zavřít (ne neprodyšně – jedná se o aerobní organismy) a nechat plíseň růst na vhodném místě – ideálními podmínkami jsou pokojová teplota, vlhko a přístup vzduchu.
Při manipulaci s plísněmi vedeme žáky k maximální opatrnosti, vzorky zplesnivělých potravin otvíráme jen na nezbytně nutnou dobu, pod binokulární lupou pozorujeme vzorky uzavřené v Petriho misce. Opatrnou manipulací s plísněmi bráníme šíření spór. Upozorníme žáky na nebezpečí plísní jako potencionálních patogenů. Po skončení práce si umyjeme ruce mýdlem a pracovní desky stolů otřeme např. zředěným roztokem SAVA, popř. jiným desinfekčním čisticím prostředkem. Místnost, ve které jsme prováděli praktika, dobře vyvětráme!
Některé druhy plísní jsou velmi těžko smáčitelné, takže je obtížné připravit preparát bez vzduchových bublin. V takových případech je možné připravit preparát do ethanolu a ten postupně nahradit vodou (z jedné strany přidáváme vodu a z druhé odsáváme ethanol filtračním papírem). Pro kreslení, identifikaci, popř. měření je vhodnější připravovat preparát v laktofenolu, pro běžné školní pozorování však stačí preparáty ve vodě nebo fyziologickém roztoku.
Při tvorbě mikroskopického preparátu je třeba manipulovat s plísní co nejopatrněji, sebrat s pomocí preparačních jehel opravdu pouze mycelium plísně (bez částí substrátu) a pomocí preparačních jehel vzorek dobře narovnat a rozprostřít. Častou chybou jsou příliš husté preparáty, na kterých kvůli částicím substrátu nebo nahloučeným částem mycelia není možné prosvítit jednotlivá vlákna mycelia nebo pak preparáty kde jsou pouze popraskaná sporangia a vysypané spory (poškození v souvislosti s hrubou manipulací s křehkým objektem).
Abychom získali preparát s neprasklými sporangii, doporučíme žákům, aby odebírali vzorek ze světlejších (nezralých) částí nárostu plísně.
Plíseň (Mucor) je známým rodem ze skupiny zygomycet. Pokud připravený preparát má jiné než popisované znaky, může se jednat o další zástupce spájivých hub. V naší databázi najdete ještě úlohu zaměřenou na pozorování rodu kropidlovec (Rhizopus). Dalšími rody jsou pak např. rod Absidia – obloukovka, Rhizomucor apod. Určovacími znaky jsou například přítomnost a tvar kolumely, tvar a větvení sporangioforů, přítomnost rhizoidů, velikost a tvar spor apod.
Dalšími druhy plísní se zabývají také úlohy 101, 102, 103, 104, 105 a 106.
Pro bližší určování plísné může posloužit řada internetových zdrojů. Jedním z nich je tento Miniatlas mikroorganismů na stránkách VŠCHT nebo přehled zástupců zygomycet na stránkách katedry botaniky PřF UK.

Obrazová dokumentace


Plíseň hlavičková (Mucor sp.) – Mycelium plísně se sporangii na jahodě . Stereomikroskop model SZS 1002-T ZOOM; objektiv – zoom 3 – 4/okulár 10 + Nikon Coolpix L20	A – celkový pohled na nárůst plísně; B – porovnání nezralých a zralých sporangií; 1 – sporangiofor; 2 – zralé sporangium; 3 –nezralé sporangium; 4 – hyfy mycelia


Plíseň hlavičková (Mucor sp.) – Sporangia na sporangioforech. Vitální preparát ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 20/okulár 10 + kamera CMOS 2	1 – sporangiofor; 2 – sporangium; 3 – sporangiospory uvolněné ze sporangií


Plíseň hlavičková (Mucor sp.) – Detaily sporangií, kolumel a sporangiospór. Vitální preparát ve vodě. Mikroskop LP 3012-T; objektiv 20, 40/okulár 10 + kamera CMOS 2	A – detail sporangiospór; B; C – sporangia; D; E – sporangiofor s odhalenou kolumelou; 1 – sporangiofor; 2 – sporangium; 3 – sporangiospory; 4 – kolumela (rozšířené zakončení sporangioforu, které je uvnitř sporangia a je viditelné až po uvolnění výtrusů při zralosti sporangia); 5 – límeček (zbytek blány, která kryla nezralé sporangium)